侵染天南星科植物病毒的分子鉴定及其生态学研究

通过病毒粒子部分提纯和形态学观察 ,发现侵染我国南方天南星科植物的病毒主要有线状和球状两种形态 .经病毒基因组序列分析确定线状病毒为芋花叶病毒 (DsMV) ;经血清学反应和序列分析确定球状病毒为黄瓜花叶病毒 (CMV) .CMVCP基因序列同源性分析的结果表明 ,侵染天南星科的CMV是相对独立的种内变异类型 ,归属于亚组I.同时 ,CMV存在对天南星科植物的适应性变异 .对采自我国海南、湖南、浙江、上海等地的 12 6个天南星科植物样品进行RNA核酸斑点杂交检测 ,获得病毒检测结果 .海南省样品DsMV的检出率为 73.3% ,CMV的检出率为 4 6 .7% ;湖南省样品DsMV的检出率为 10 0 % ,CMV的检出率为 38.5 % ;浙江省样品DsMV的检出率为 93.0 % ,CMV的检出率为 7.0 % ;上海市样品DsMV的检出率为 10 0 % ,尚没有检测到CMV .首次证实了自然条件下CMV作为天南星科植物主要病毒的存在 ,在我国南方地区 ,该病毒对天南星科植物的自然侵染受到气候、季节和寄主等生态因子的影响 .

引起掌叶半夏花叶病的芋花叶病毒

在表现花叶症状的天南星科药用植物掌叶半夏（Ｐｉｎｅｌｉａｃｏｒｄａｔａ）上检测到一种线状病毒，病毒粒子的最大分布范围为７２５～７７６ｎｍ，平均长度为７４５ｎｍ。提纯病毒Ａ２６０／Ａ２８０为１．２８，电镜下观察为均一的线状病毒粒子。经免疫电镜测定该线状病毒与芋花叶病毒（ＤＭＶ）抗血清有强的阳性反应。在病叶横切面的细胞质里观察到具风轮状、卷筒状和片层状聚集结构，在纵切面上为束状的细胞质内含体以及分散的和紧密聚集的线状病毒粒子。寄主反应测定结果表明，该病毒侵染天南星科植物，不侵染其它１１科３５种非天南星科供试植物。据上述试验结果，该病毒分离物认为属芋花叶病毒。

我国13种天南星科作物上的芋花叶病毒

用直接负染和免疫电镜方法从我国浙江省(杭州、奉化、温州等地)、上海、北京、福建、湖南等地的13种天南星科大田作物:芋(Colocasia esadenta)、魔芋(Amorphophallus sinesis)、药用植物:半夏(Pinellia ternata)、掌叶半夏(P. cordata)、盾叶半夏(P. pedatisecta)以及观赏植物:马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、海芋(Alocasia macrorrhiza)、象耳芋(Colocasia gigantea)、台果芋(Syngonium podophygum)、黄金葛(Scindapsus aureus)、广东万年青(Aglaonema modestum)、花叶芋(Caladium bicolar)、剑叶喜林芋(Philodendium oxycadium)上均检测到芋花叶病毒(Dasheen mosaicvirus, DMV)。在免疫吸附-免疫修饰电镜水平上,该病毒与DMV抗血清和PVY抗血清均有强阳性反应。在人工接种条件下,DMV各分离物均不侵染烟草等非天南星科供试植物,但接种天南星科指示植物Philodendron selloum、半夏和掌叶半夏均表现系统症状。受DMV自然感染的天南星科作物叶中,病毒粒子的平均长度为752nm,病毒粒子的最大分布范围为667～882nm。从感病植物叶组织超薄切片中观察到紧密聚集和分散的线状病毒粒子和典型的Potyvirus柱状内含体。内含体同时具有风轮状(Pinwheel)、卷筒状(Scroll-like)和片层状聚集体(Laminated aggregate)。

魔芋中芋花叶病毒的RT-PCR检测

根据已报道的DsMV中的衣壳蛋白(cp)基因序列,首先合成1对扩增DsMV的cp基因中间部分核心序列的寡核苷酸引物;然后将提取的魔芋植株的总RNA反转成cDNA,再以cDNA为模板,用上述引物进行常规PCR反应,结果扩增得到了与预期大小一致的0.35kb片段,健康魔芋植株接种DsMV后也扩增得到同样大小的片段,而健康植株则未扩增到任何片段。从而建立了魔芋中DsMV经济简便的RT-PCR检测体系,为魔芋DsMV的防治和脱毒苗的检测提供了有效手段。

芋花叶病毒检测试剂盒的研制

用IPTG诱导融合表达芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus，DMV）CP基因的菌株，通过12％SDS．PAGE和5％-20％梯度SDS—PAGE二次制备电泳获得纯化的CP免疫家兔，获得经过Western blot分析为特异的抗CP血清．硫酸铵沉淀初步提取IgG，然后用Protein A—Red Sepharose亲和层析进一步纯化IgG，IgG与甘油1：1混合获得效价1：3100的一抗，将一抗、羊抗兔二抗和4-硝基苯基磷酸二钠组成DMV检测试剂盒．用研制的检测试剂盒对芋、魔芋和马蹄莲叶片样品的间接ELISA检测表明，DMV在田间普遍发生，并确定研制的试剂盒完全可用于DMV检测．

崇明芋花叶病毒病的初步鉴定

芋花叶病毒病是造成天星科植物产量下降,品质劣变的主要原因。作者通过田间调查、电镜负染和核酸斑点杂交的方法,分析了崇明特产品种崇明香酥芋和崇明县主栽品种浙江红梗芋芋花叶病毒病(Dasheenmosaicvirus,DMV)的发病情况,初步推断崇明县境内芋艿已被芋花叶病毒侵染,并探讨了用茎尖分生组织培养生产脱除DMV种苗的必要性。

几种天南星科植物受芋花叶病毒感染后的叶片组织病变研究

对自然感染芋花叶病毒（ＤＭＶ）的几种天南星科植物的叶片超微结构进行电镜观察的结果表明：ＤＭＶ感染天南星科植物同时形成风轮状（Ｐｉｎｗｈｅｅｌ）、卷筒状（Ｓｃｒｏｌｌ－ｌｉｋｅ）和片层状聚集体（ｌａｍｉｎａｔｅｄａｇｒｅｇｇａｔｅｓ）结构的细胞质内含体（即柱状内含体，ＣｙｌｉｎｄｅｒｉｃａｌＩｎｃｌｕｓｉｏｎ，ＣＩ）。ＤＭＶ所产生的细胞质内合体与Ｅｄｗａｒｄｓｏｎ等所划分的Ⅱ型ＣＩｓ相符。在叶肉细胞质中还观察到分散的病毒粒子、大量紧密聚集的病毒粒子以及主要由病毒粒子组成的类似病毒包含体（Ｖｉｒｏｐｌａｓｍａ）的结构。同时，不同寄主来源对ＤＭＶ细胞质内含体的形状有明显影响：来源于自然感病的马蹄莲细胞中ＣＩｓ横切面上主要是风轮状结构组成；在芋、广东万年青的感病细胞中亦是以风轮状结构占优势，但具有一定数量的片层状结构和卷筒状结构；在魔芋、半夏和海芋的细胞中则以卷简状结构为主，具有一定数量的片层状结构，有的甚至完全不形成风轮状．

侵染半夏的两种病毒的分离纯化和初步鉴定

用自然感染的半夏（Ｐｉｎｅｌｌｉａｔｅｒｎａｔａ）为材料，经粗提纯后检查到一种线状病毒和一种球状病毒，用两种方法对担提纯样品中的病毒粒子进行了分离纯化。１０％－７０％连续甘油梯度８００００ｇ离心１５０分钟获得两条病毒带，经紫外吸收测定均为强的核蛋白吸收峰，病毒粒子检查分别为球状和线状病毒粒子，线状病毒经浓缩收集为均一成份．与芋花叶病毒（Ｄａｓｈｅｅｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＤＭＶ）抗体有强的阳性反应。粗提纯样品经０．８％琼脂糖凝胶电脉分离为一条蛋白带，该条带回收后经紫外吸收测定为核蛋白吸收峰，电镜下检查为均一的球状病毒，以ＴＭＶ为对照、醋酸铀（ＵＡＣ）负染后测得该球状病毒（ｐｉｎｅｌｌｉａｓｐｈｅｒｉｃａｌｖｉｒｕｓ１．ＰｓＶ－１）的大小为３１．７ｎｍ；戊二醛固定后磷钨酸（ＰＴＡ）负染测得ＰｓＶ—１的大小为３４．０ｎｍ。各组分经ＳＤＳ－聚丙烯酸胺凝焦电泳分析测得线状病毒和球状病毒的外壳蛋白分子量分别为２０ＫＤ和２８ＫＤ。初步确定线状病毒为ＤＭＶ．球状病毒ＰｓＶ—１为侵梁天南星科半夏的一种新病毒。

红掌花叶病病原鉴定及检测方法的建立

以红掌为材料,利用RT-PCR方法鉴定出红掌花叶病的一种病原——芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,DMV),并建立了该病毒的RT-PCR检测方法。依据该方法,将从0.1 g染病组织中提取的总RNA稀释500倍,仍能从中检测出DMV的存在,说明该方法的灵敏度高。该检测方法的建立,为红掌栽培,尤其是工厂化生产红掌无毒种苗提供了技术支持。

湖南省10种天南星科作物DsMV和CMV的检测

利用32P标记的cDNA探针对采集于湖南省永州等地的10种天南星科观赏植物和大田作物绿帝王(Philodendron sodiroi)、半夏(Pinellia ternata)、海芋(Alocasia macrorhiza)、马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、龟背竹(Monstera deliciosa)、尖尾芋(Alocasia cucullata)、白蝶合果芋(Sygonium podophyl lum)、羽裂蔓绿绒(Philodendron selloum)、广东万年青(Aglaonema modestum)、芋(Colocasia esculenta) 进行了芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,DsMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的检测,同时对部分样品进行病毒提纯、病毒粒子观察和内含体结构检查。结果显示:DsMV在10种植物上普遍存在,是最主要的病毒病原;同时首次在芋、绿帝王和广东万年青等3种植物上检测到CMV和DsMV的复合侵染。

山东省芋花叶病毒病的田间调查及鉴定

为明确芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,Ds MV)在山东芋种植区的发生和遗传进化,在山东潍坊、青岛、烟台、日照和临沂等5个芋主栽区进行调查,对采集样品进行病毒病病原鉴定、序列分析和遗传进化分析。结果显示,芋花叶病毒的检出率为55.9%,在5个地区皆有分布。5个Ds MV分离物cp基因的核苷酸序列相似性为88.5%~91.9%,氨基酸序列相似性为93.4%~97.5%;与国内外已报道代表性Ds MV分离物cp基因的核苷酸与氨基酸的序列相似性分别为74.8%~99.4%、79.7%~99.1%。遗传进化分析显示,Ds MV山东分离物与日本分离物(Ds23)、中国分离物(ND和ZAN)和美国分离物(Ds MV-U2)亲缘关系较近,聚在同一分支。综上,Ds MV在山东省芋主栽区发生普遍,其cp基因序列之间变异相对较大。

引起马蹄莲花叶病的芋花叶病毒

在采自杭州、北京、上海等地的表现花叶和扭曲症状的马蹄莲(Zanledeschia aethiopica)上检测到一种线状病毒。经测定,其平均粒子长度为745nm,病毒粒子最大分布范围为720—750nm。该病毒经免疫电镜观察与芋花叶病毒(DMV)有紧密的血清学关系,且与3个PVY抗血清也有一定的反应。在病叶细胞中观察到紧密聚集。松散聚集和分散的线状病毒粒子和典型的风轮状内含体。作者认为:感染马蹄莲的该种病毒符合芋花叶病毒的特征。本文对该病毒的血清学关系和组织病变情况进行了分析讨论。

芋病毒病田间调查及毒氟磷对芋病毒病的防治效果

对芋病毒病及类似病害症状进行调查,其症状表现主要分为羽状花叶、叶片向上卷曲并伴有黄化或花叶、脉间黄化、明亮褪绿黄斑、褪绿斑点(斑驳)及叶片皱缩和叶缘黄化。采用RT-PCR和PCR技术对随机采集的32份表现症状的鄂芋一号样品进行了芋花叶病毒(DsMV)和芋杆状病毒(TaBV)2种病毒的检测,检出率均为68.8%。同时,利用30%毒氟磷可湿性粉剂500倍液和1 000倍液对芋病毒病进行田间药效试验,第一次施药后10 d调查,毒氟磷可湿性粉剂500倍液和1 000倍液的防治效果分别为30.9%和24.9%;第二次施药后15 d调查,500倍液和1 000倍液防治效果分别为72.8%和59.4%。田间药剂试验结果表明,毒氟磷可湿性粉剂500倍液比1 000倍的防治效果好,从田间芋头长势可看出,毒氟磷对芋头生长有明显的促进作用。

湖北及山东地区栽培芋病毒病的田间调查及其病原的分子检测

对湖北及山东地区种植的芋调查发现,田间芋病毒病发生普遍,症状表现主要有花叶、羽状斑驳、畸形皱缩、褪绿斑点等。2010年9月30日对武汉蔬菜科学研究所国家种质武汉水生蔬菜资源圃种植的芋进行调查发现,以上4种症状的田间显症率分别为26.92%,16.67%,28.21%和3.85%,田间调查时未发现蚜虫等媒介昆虫。对不同来源的芋叶片样品进行芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus,DsMV）的RT-PCR检测,各症状田间检出率为21.1%-42.9%。

荔浦芋脱毒苗诱导条件的优化

为了提高荔浦芋的品质和产量，采用热处理和茎尖培养相结合的方法，研究诱导荔浦芋脱毒苗的最佳组合条件。结果表明：荔浦芋无根苗置于37．8℃的恒温培养箱中处理15d，然后剥取0．5～0．6mm的茎尖，在MS＋3％蔗糖＋O．7％琼脂＋O．5mg·L6-1 6BA和0．1mg·L^-1 NAA的培养基上培育成苗，可有效去除荔浦芋的芋花叶病毒。

魔芋芋花叶病毒的检测

为评价魔芋(Amorphophallus konjac)体内芋花叶病毒检测方法,利用人工接种芋花叶病毒的魔芋作为试验材料,分别采用DAS-ELISA、RT-PCR、荧光定量PCR等3种方法进行检测。结果表明,对于人工接种芋花叶病毒1周,植株出现有明显病征的魔芋,荧光定量PCR检测的灵敏度最高、RT-PCR次之,而DAS-ELISA酶联检测法灵敏度较低。

侵染安康魔芋的芋花叶病毒外壳蛋白基因克隆及分析

采用RT-PCR方法克隆了侵染安康魔芋的芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus, DsMV)cp完整基因序列,结果表明:DsMV魔芋分离物cp基因大小为903 bp,推导编码的外壳蛋白由301个氨基酸组成。Blast比对结果显示,覆盖度仅有72%~80%,一致性为80.30%~87.98%;系统发育分析显示DsMV安康魔芋分离物独立于组III中,具有较大的分子变异,且不同寄主分离物和不同地理位置来源的DsMV在进化树中没有明显相关性。

芋花叶病毒RNA提取前处理方法优化及快速检测体系的构建

芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus, DSMV)是芋在无性繁殖过程中不断积累并遗传的最为严重的一种植物病毒。为解决芋因受病毒侵染而导致的品种退化,构建快速且高效的芋花叶病毒RNA提取前处理及快速检测方法,本研究通过对芋叶总RNA提取前处理过程进行改良和优化,探究总RNA中DSMV的两步式RT-PCR、一步式RT-PCR及RT-qPCR快速检测体系。采用液氮联合组织研磨仪的植物总RNA提取前处理法,研磨时间20 min,研磨频率30(1/s),钢珠1个的最佳研磨条件,能获得含量纯度均较高的芋叶总RNA;一步式RT-PCR体系为总RNA模板1.0μL,10×PCR buffer 2.5μL,25 mM Mg1.0μL,2.5 mM dNTPs 1.0μL,10μmol/L上下游引物各1.0μL,200 U/μL逆转录酶0.5μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶1.0μL,25.0μL总体系。一步式RT-PCR体系具有比两步式更快速、简便且灵敏的检测效果。

侵染云南花魔芋的马铃薯Y病毒属病毒分离物的检测及分子鉴定

YN80 was isolated from Amorphophallus rivieri Durieu showing mosaic and crinkle symptoms in Songming,Yunnan province.Flexuous filamentous particles were found in diseased leave sap and pinwheel inclusion bodies were found in the leave tissue.YN80 had positive reaction to universal antibody of Potyvirus by DAS-ELISA.3’-terminal sequence of YN80 was cloned and sequenced.cp gene of YN80 consisted of 987 nt,encoded 328 aa(36.1 kDa).Sequence analysis showed that YN80 shared the highest identity(97.0%)with CP amino acid sequence of Dasheen mosaic virus(DsMV).These data indicated that YN80 was an isolate of DsMV.This is the first molecular identification of A.rivieri Durieu isolate of DsMV in China.

芋花叶病毒的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

采用RT-PCR技术对采自中国湖北、浙江和山东的91份芋[Colocasia esculenta（L.）Schott]样品的芋花叶病毒（Dasheen mosaicvirus,DsMV）进行了检测,检出率为26.4%。对其中14个DsMV分离物的317bp扩增产物（为外壳蛋白基因的一部分）序列分析的结果显示,各分离物内的核苷酸变异相对较低,而分离物间存在较大的分子变异,相似性为68.3%~97.8%。对来自湖北和浙江的2个DsMV分离物DsMV-SCS和DsMV-JH的外壳蛋白基因（coatproteingene,cp）进行了测序,全长分别为951bp和987bp,二者cp核苷酸和氨基酸序列相似性分别为79.0%和82.3%,与已报道DsMV的cp核苷酸和氨基酸序列相似性分别为73.0%~92.1%和74.8%~98.2%,在构建的系统发育树上聚在两个不同的簇,各DsMV分离物的系统进化关系与其寄主和地理来源无显著相关性。