AFM研究蝙蝠葛碱对daudi细胞毒性的影响

利用原子力显微镜、CCK-8实验和流式细胞术研究了蝙蝠葛碱(dauricine)对B细胞淋巴瘤daudi细胞的细胞毒性。蝙蝠葛碱能显著抑制daudi细胞的增殖。CCK-8实验表明,细胞存活率与蝙蝠葛碱浓度存在时间依赖和剂量依赖关系。经10～50μmol/L的蝙蝠葛碱作用24 h后,daudi细胞存活率从(89.8±4.3)%降至(11.2±3.2)%;48 h后,存活率从(68.9±2.6)%降至(2.5±0.5)%。流式细胞术表明蝙蝠葛碱处理dau-di细胞24 h后,凋亡率从5.2%增至28.2%(60μmol/L)。AFM数据显示对照组细胞呈圆形,表面较光滑。经蝙蝠葛碱处理后,daudi细胞坍塌,超微结构显示细胞表面粗糙、凹凸不平。此外,经不同浓度蝙蝠葛碱作用的daudi细胞,其线粒体膜电位随着药物浓度的加大而降低。蝙蝠葛碱能显著抑制daudi细胞生长增殖。

紫杉醇对Daudi细胞增殖活性与表面超微结构的影响

目的:研究紫杉醇对Burkitt淋巴瘤细胞株Daudi细胞凋亡的影响。方法:用原子力显微镜(AFM)分析细胞膜超微结构的改变,CCK8法检测Daudi细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)测定凋亡率。结果:AFM显示紫杉醇可引起细胞形貌的改变,正常Daudi细胞呈圆形,表面较光滑;紫杉醇处理后,Daudi细胞坍塌,细胞表面粗糙、凹凸不平。紫杉醇对Daudi细胞的增殖具有抑制作用,且呈时间浓度依赖性。FCM检测示Daudi细胞凋亡率各实验组均明显高于对照组(P<0.05),呈浓度依赖性。结论:紫杉醇可改变细胞膜超微结构,抑制Daudi细胞的增殖,促进其凋亡。

顺铂诱导Daudi细胞增殖抑制中分化抑制因子3的表达分析

目的探讨Id3在顺铂诱导人Burkitt's B淋巴瘤细胞(Daudi)增殖抑制和凋亡中的作用。方法应用顺铂处理人Daudi细胞,台盼蓝染色法检测不同浓度的顺铂对Daudi细胞生长的抑制作用;流式细胞仪(FCM)分析细胞周期和凋亡率;用RT-PCR检测顺铂处理后Id3、Id2、钙调素(CaM)基因表达水平变化。结果Daudi细胞增殖抑制率随顺铂浓度的增加而增加;2μg/ml的顺铂作用24h后,Daudi细胞表现出G1期阻滞,S期和G2/M期细胞比例下降;AnnexinⅤ/PI双染法和FCM结果表明,顺铂可诱导Daudi细胞发生凋亡;RT-PCR结果表明,顺铂处理Daudi细胞可导致Id3 mRNA的表达增加,而Id2、CaM mR-NA无明显变化。结论Id3基因的上调表达可能在顺铂抑制Daudi细胞增殖、诱导细胞凋亡中发挥作用。

PHI对Burkitt淋巴瘤Daudi细胞株组蛋白甲基化和乙酰化调控的实验研究

本研究观察异硫氰酸苯己酯(PHI)在体外对Burkitt淋巴瘤Daudi细胞株的作用及对淋巴瘤细胞表观遗传学调控的影响,初步探讨其可能的机制。用流式细胞术检测PHI处理后的细胞凋亡率,蛋白免疫印迹法检测PHI处理后的细胞的组蛋白H3、H4乙酰化和H3K4、H3K9甲基化状态改变。结果表明,PHI诱导细胞凋亡并提高组蛋白H3、H4乙酰化水平,组蛋白H3K4甲基化增强,而H3K9甲基化减弱。结论:PHI能上调与转录激活相关的组蛋白H3乙酰化水平及甲基化H3K4,下调转录抑制相关的组蛋白甲基化H3K9,促进肿瘤细胞凋亡,PHI可作为淋巴瘤的靶向治疗药物。

STGC3基因高表达Daudi细胞系的建立与鉴定

目的探讨STGC3基因高表达对Daudi细胞形态、倍增时间和增殖速度的影响。方法采用电穿孔基因转染技术,将pCDNA3.1(+)/STGC3真核表达载体导入Daudi细胞系,G418筛选,建立高表达STGC3基因的Daudi细胞系,利用Western-blotting检测转基因细胞系中STGC3蛋白的表达;运用免疫细胞化学和HE染色方法及绘制细胞生长曲线,了解STGC3基因表达在Daudi细胞中的定位,以及对细胞倍增时间和增殖速度的影响。结果在转基因的Daudi细胞系中,STGC3蛋白高表达并定位于胞浆与胞核。转染STGC3基因后,Daudi细胞倍增时间延长,增殖速度明显减慢(P<0.05)。结论成功建立STGC3基因高表达Daudi细胞系。

PHI对Burkitt淋巴瘤Daudi细胞株凋亡调控的实验研究

目的:研究PHI在体外对伯基特淋巴瘤淋巴瘤Daudi细胞株的作用,观察PHI对诱导淋巴瘤细胞凋亡的影响,初步探讨其可能的机制。方法:用MTT比色法检测体外Daudi细胞在PHI作用后增殖率的变化。用流式细胞术观察PHI诱导Daudi细胞凋亡。用蛋白免疫印迹法(Western Blot)观察在PHI作用下凋亡相关蛋白Bcl-2、proCaspase-9、proCaspase-3、McL-1、XIAP、Cyt-C表达的变化。结果:经PHI处理的Daudi细胞增殖受到明显抑制;PHI可下调Daudi细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、McL-1、XIAP、Cyt-C,proCaspase-9、proCaspase-3的表达,诱导Daudi细胞凋亡。结论:PHI抑制伯基特淋巴瘤淋巴瘤细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、McL-1、XIAP、Cyt-C、proCaspase-9、proCaspase-3的表达,可能通过影响线粒体凋亡途径促进Daudi细胞凋亡,抑制其细胞增殖,可能是治疗淋巴瘤的潜在新药。

磁感应热疗联合利妥昔单抗对Daudi细胞作用的研究

目的研究磁感应热疗联合利妥昔单抗对人淋巴瘤Daudi细胞的作用。方法研究磁性介质与人淋巴瘤Daudi细胞的生物相容性,并对磁性介质的升温性能进行检测。将对数生长期的Daudi细胞分为对照组(只含等量溶媒)、磁感应组(加入磁性介质)、利妥昔单抗组(100μg/ml利妥昔单抗)和联合组(加入磁性介质和100μg/ml利妥昔单抗)。采用CCK-8法检测各组Daudi细胞的增殖抑制率,采用流式细胞术检测各组Daudi细胞的凋亡及细胞周期情况。结果本实验过程中选用的空心不锈钢球,生物细胞相容性和发热效率良好,Daudi细胞的毒性等级为0或1级;与磁感应组、利妥昔单抗组相比,联合组Daudi细胞的增殖抑制率增高(P﹤0.05),凋亡率明显增高(P﹤0.01),S期细胞所占比例明显增多(P﹤0.01),G0/G1和G2/M期细胞所占比例明显减少(P﹤0.01)。结论磁感应热疗磁性介质应用于淋巴瘤治疗在细胞水平是可行的;磁感应热疗单独使用可抑制Daudi细胞的增殖,诱导细胞凋亡,改变细胞周期,利妥昔单抗注射液与磁感应热疗联合应用时能够明显增强这种效应。

Akt抑制剂与利妥昔单抗联合应用对伯基特淋巴瘤细胞株Daudi增殖及凋亡的影响

目的探讨Akt抑制剂（AZD5363）与利妥昔单抗联合应用对伯基特淋巴瘤（BL）细胞株Daudi增殖和凋亡的影响,并探讨其相关机制。方法培养人BL细胞株Daudi,将其分为对照组（只含等量溶媒）、AZD5363组（加入40μmol/L AZD5363）、利妥昔单抗组（加入50μg/m L利妥昔单抗）、联合用药组（加入40μmol/L AZD5363＋50μg/m L利妥昔单抗）,置于培养箱中培养24-72 h。分别采用CCK8法、流式细胞术测算AZD5363、利妥昔单抗及两者联合对Daudi细胞的增殖抑制和凋亡率,采用Western blotting法检测细胞磷酸化Akt（p-Akt）和总Akt（T-Akt）蛋白。结果与AZD5363组、利妥昔单抗组相比,联合用药组在24、48、72 h时Daudi细胞增殖抑制率高（P均〈0.05）。AZD5363组、利妥昔单抗组、联合用药组与对照组相比,联合用药组与AZD5363组、利妥昔单抗组相比,干预Daudi细胞48、72 h后细胞凋亡率高（P均〈0.05）。对照组、AZD5363组、利妥昔单抗组、联合用药组细胞p-Akt相对表达量分别为0.59±0.06、0.33±0.03、0.45±0.04、0.18±0.04,AZD5363组、利妥昔单抗组、联合用药组与对照组相比,联合用药组与AZD5363组、利妥昔单抗组相比,P均〈0.05。结论 AZD5363与利妥昔单抗联合应用可增强对BL细胞株Daudi的增殖抑制作用,促使细胞凋亡,其作用机制可能是通过抑制Akt磷酸化,阻断PI3k/Akt信号转导通路,从而发挥抗肿瘤效应。

干扰素-α1b增强人γδT细胞对Daudi细胞系的细胞毒活性及相关机制

目的探讨干扰素-α1b(IFN-α1b)对人γδT细胞体外杀伤肿瘤细胞的促进作用及其相关机制。方法用IFN-α1b预处理的Daudi细胞作为靶细胞;用IFN-α1b预处理的γδT细胞作为效应细胞;LDH法检测γδT细胞对Daudi细胞的细胞毒活性;ELISA检测效靶细胞混合上清中γδT细胞分泌的颗粒酶B和γ干扰素水平;流式细胞计量技术检测IFN-α1b预处理Daudi细胞表面Fas受体和应激蛋白配体ULBP3/ULBP4的表达,以及γδT细胞表面活化分子CD69和CD25的变化。结果IFN-α1b分别预处理Daudi细胞和γδT细胞都能显著增强γδT细胞对Daudi细胞的细胞毒活性(P<0.0001);IFN-α1b预处理的γδT细胞分泌颗粒酶B和γ干扰素的能力显著提高(P<0.05);IFN-α1b能上调Daudi细胞表面Fas受体和应激配体ULBP4的表达水平,而应激配体ULBP3的表达没有变化;IFN-α1b还能上调γδT细胞表面CD69的表达水平,而CD25的表达没有变化。结论IFN-α1b能通过不同的途径促进人γδT细胞对肿瘤细胞系Daudi细胞的体外细胞毒活性,两者的联用能增强γδT细胞的肿瘤治疗疗效。

两株抗人CD40配体单克隆抗体的制备及生物学特性的研究

目的 :研制功能性抗CD4 0L单克隆抗体 ,探讨其生物学特性及其运用价值。方法 :采用B淋巴细胞融合、免疫荧光、免疫印迹和竞争抑制等方法获得鼠抗人CD4 0LmAb ,通过Daudi细胞生长抑制试验、混合淋巴细胞反应观察抗CD4 0LmAb的生物学功能。结果 :经表型分析、Westernblot和竞争抑制试验 ,证实mAbB1、mAb4F1是识别人CD4 0L分子的特异性单抗 ,且识别的位点不同 ;mAbB1、mAb4F1均能不同程度地拮抗CD4 0L TC介导的Daudi细胞生长抑制和抑制混合淋巴细胞反应。结论 :成功地获得两株能稳定分泌特异性抗人CD4 0L单克隆抗体的杂交瘤 (1B1、4F1) ,这两株单抗对CD4 0L的生物学功能具有明显的阻断作用 。

B细胞非霍奇金淋巴瘤小鼠模型的建立

背景与目的:近年来非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma,NHL)发病率呈上升趋势,其中侵袭性NHL占了很大的比例,然而传统化疗方案提高NHL疗效的空间有限。本研究旨在建立淋巴瘤小鼠模型,为探讨治疗NHL新方案并研究其药物作用机制提供动物模型。方法:应用人弥漫大B细胞NHL细胞株SU-DHL-4及人Burkitt淋巴瘤细胞株Daudi,经尾静脉注射入SCID小鼠体内,探索建立淋巴瘤小鼠模型的条件及特点。Daudi淋巴瘤小鼠分为对照组及美罗华治疗组,观察小鼠的发病情况及生存时间。结果:SU-DHL-4淋巴瘤小鼠在中位时间39.5d后开始发病,主要表现为精神萎靡、消瘦、竖毛、活动迟缓,于小鼠腹腔、尾部或后肢部位出现肿块,未发现肝脏、脾脏、骨髓等脏器出现淋巴瘤细胞浸润。Daudi淋巴瘤小鼠于中位时间30.5d发病,出现双后肢瘫痪,于瘫痪后9.5d左右死亡。Daudi淋巴瘤小鼠的脏器大多受淋巴瘤细胞的累及,骨髓中出现大量Daudi细胞浸润。美罗华治疗使小鼠骨髓中的Daudi细胞呈现明显的凋亡形态。对照组Daudi淋巴瘤小鼠的中位瘫痪时间及生存时间分别为30.5d及40d,美罗华治疗组的小鼠分别为52.5d及76.5d,美罗华治疗组小鼠的中位瘫痪时间及生存时间显著延长(P<0.05)。结论:应用SU-DHL-4细胞及Daudi细胞均可以成功建立B细胞NHL小鼠模型。

RNA干扰survivin基因提高淋巴瘤细胞对阿霉素的敏感性

目的:探讨RNA干扰下调Burkitt淋巴瘤Daudi细胞系凋亡抑制基因survivin的表达对阿霉素敏感性的影响。方法:构建survivin发夹RNA(shRNA)真核表达载体,脂质体介导转染Daudi细胞。多重RT-PCR检测survivin mRNA表达;Western blotting检测Survivin蛋白表达;流式细胞仪(FCM)检测干扰前后细胞凋亡率;MTT法检测干扰前后细胞对化疗药物阿霉素(adriamycin,ADR)敏感性变化。结果:与无功能control-shRNA处理组和PBS处理组比较,转染survivin-shRNA细胞的survivin mRNA和蛋白表达率显著降低,抑制率分别为62.32%和61.88%(P<0.05);FCM结果示转染组细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)显著高于两对照组(P<0.05);MTT结果显示,转染组细胞的阿霉素半数抑制浓度(IC50)为(0.25±0.43)μmol/L,显著低于无功能control-shRNA处理组(0.87±0.21)μmol/L和PBS处理组(0.91±0.36)μmol/L,P<0.05;相同剂量ADR对转染细胞的生长抑制率明显高于PBS组和control组。结论:发夹RNA干扰survivin基因可显著提高Daudi细胞凋亡率和对化疗药物阿霉素的敏感性。

β-连环素在白血病细胞株的异常定位研究

β-连环素是Wnt信号通路关键的信号传递子,其在细胞的异常定位引起下游靶基因的转录是多种实体肿瘤发生的原因之一。由于造血细胞缺少典型的黏着连接(adherens junction,AJ),因此对β-连环素在血液肿瘤的表达及定位并无较多的研究。本研究探讨4种常见的白血病细胞株(Daudi, Jurkat, K562和Thp-1)中β-连环素蛋白的定位及β-连环素基因mRNA的表达水平,了解血液肿瘤中是否有β-连环素蛋白的定位异常,以期发现白血病新的发生机制,为寻找新的特异治疗靶点提供线索。用免疫细胞化学法检测β-连环素在白血病细胞系中的定位,用实时定量RT-PCR法测定β-连环素mRNA表达水平。结果表明4种白血病细胞株有两种(Jurkat、Thp-1)存在β-连环素的异常定位,且β-连环素mRNA表达增高,但在Jurkat和Thp-1细胞中的β-连环素mRNA低于Daudi和K562细胞。这4种白血病细胞株中β-连环素基因的mRNA表达水平与其异常定位无相关性。结论β-连环素定位异常可能参与部分血液肿瘤的发生,引起β-连环素定位异常的机制并不是发生在转录水平。

六种肿瘤细胞株BLM基因转录水平的研究

BLM基因的不同突变是导致Bloom综合征(Bloom'ssyndrome)的病因。BLM基因突变使姐妹染色单体互换率(sisterchromaticexchange,SCE)增高,细胞DNA修复功能降低,这样受损的DNA很容易随细胞分裂而传入子细胞,细胞稳定性下降。临床表现为免疫缺陷,恶性肿瘤易患体质等等。本研究对BLM基因在肿瘤细胞株和正常人中表达的差异进行研究,以期发现肿瘤新的发生机制,为寻找新的特异分子治疗靶点提供线索。应用PTPCR方法检测正常人造血细胞和六种肿瘤细胞株中BLM基因的mRNA水平,并作序列检测。结果表明,六种肿瘤细胞株均高表达BLMmRNA,但未见BLM基因结构异常,而正常人表达量很低(P<0.01)。结论:在本研究中的6种肿瘤细胞株高表达BLMmRNA,肿瘤细胞株和正常人BLMmRNA表达水平有显著差异性。BLM异常可能参与肿瘤的发生或是导致耐药的原因之一。

hsa-miR-150再表达对Burkitt淋巴瘤增殖与凋亡的影响

目的探讨hsa-miR-150在正常人B淋巴细胞群及人Burkitt淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma,BL)中的表达,分析hsa-miR-150再表达对人BL细胞株Daudi及Raji体外增殖及凋亡的影响。方法采用流式细胞技术(flow cytometry,FCM)从扁桃体炎标本中分选出正常B淋巴细胞群,应用qRT-PCR技术检测hsa-miR-150在细胞群中的表达,同时检测hsa-miR-150在BL细胞株Daudi及Raji中的表达;将载有hsa-miR-150的慢病毒稳定转染Daudi及Raji,采用FCM、MTT及IP染色法观察hsa-miR-150再表达对Daudi及Raji细胞增殖与凋亡的影响。结果 FCM从扁桃体组织中分选出4群正常的B淋巴细胞群,分别为nave细胞(NC)、中心母细胞(CB)、中心细胞(CC)、记忆B细胞(MC),hsa-miR-150在NC、CB、CC、MC中的表达呈动态性,相对于NC,CB及CC低表达hsa-miR-150(P<0.001)。与正常B淋巴细胞相比,hsa-miR-150在Daudi及Raji中明显低表达(P<0.001)。与对照组相比,实验组细胞增殖明显受抑制(P<0.001),凋亡明显增加(P<0.001)。结论 hsa-miR-150对正常B淋巴细胞的分化具有重要作用,与BL的发生、发展可能存在一定关系;hsa-miR-150再表达可抑制Daudi及Raji细胞增殖,诱导其凋亡,为后续诱导分化治疗研究打下基础。

人CD20跨膜区与g3pN端融合基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :构建g3pN1 hCD2 0跨膜及胞外区基因表达载体 ,并在大肠杆菌中进行高效融合表达。方法 :利用反转录PCR和PCR方法 ,分别从Daudi细胞和M13K0 7噬菌体中扩增hCD2 0基因和编码g3pN1蛋白N1端的基因 ,并重组到pTIG Trx表达载体中 ,在大肠杆菌中融合表达。结果 :表达产物可被抗CD2 0分子的单克隆抗体 (mAb)识别。结论 :成功地表达并鉴定了目的蛋白。

BMT-1抑制急性B淋巴母细胞瘤细胞增殖活力及其机制研究

目的探讨苯并咪唑衍生物BMT-1对急性B淋巴母细胞瘤细胞增殖活力的影响及其相关机制。方法采用CCK-8方法测定BMT-1对Daudi、Nalm-6的细胞毒性;采用流式细胞技术方法检测BMT-1对Daudi细胞凋亡及线粒体膜电位的影响;采用Western Blot方法检测Daudi细胞凋亡相关蛋白PARP的表达情况。结果BMT-1对Daudi、Nalm-6细胞具有较强的细胞毒性;BMT-1可诱导Daudi细胞凋亡,引起Daudi细胞线粒体膜电位下降,并可使得Daudi细胞产生PARP蛋白剪切体。结论 BMT-1对B淋巴母细胞瘤具有细胞毒性作用,其关键机制为诱导细胞凋亡和引起线粒体膜电位下降,为BMT-1治疗急性淋巴细胞白血病提供了理论基础。

组成性JNK活化促进B淋巴瘤细胞增殖

本研究以人B淋巴瘤细胞系Daudi和Raji为研究对象,探讨组成性JNK活化对B淋巴瘤细胞增殖的影响。用Western blot检测Daudi、Raji B淋巴瘤细胞中组成性JNK的变化;用免疫荧光方法检测Daudi、raji B淋巴瘤细胞中JNK的亚细胞定位;用JNK抑制因子(SP600125)处理Daudi和raji B淋巴瘤细胞,用流式细胞术检测其细胞周期;用ATPLite法检测SP600125对Daudi、Raji B淋巴瘤细胞生长的影响。结果显示:Daudi和raji B淋巴瘤细胞有组成性JNK活化;Daudi和raji B淋巴瘤细胞JNK亚细胞定位异常,存在不同程度的入核;JNK特异性抑制因子SP600125诱导B淋巴瘤细胞Daudi、Raji G2/M期细胞比例升高,并具有时间依赖性,且G0/G1峰前出现亚二倍体峰,证实SP600125在B淋巴瘤细胞中诱导G2/M阻滞和凋亡。ATPLite检测结果显示,SP600125显著抑制Daudi和Raji B淋巴瘤细胞的生长,并随着抑制因子浓度的升高,抑制作用更加明显,呈现剂量依赖性。结论:组成性JNK活化促进Daudi和Raji B淋巴瘤细胞增殖。JNK活性的升高通过促进JNK从胞浆进入胞核来促进B淋巴瘤细胞的增殖。SP600125通过多种机制阻抑JNK的活性抑制B淋巴瘤细胞的恶性生长。JNK可作为临床治疗B淋巴瘤的潜在靶点。

抗人CD40单克隆抗体偶联纳米胶束药物载体系统的构建及其生物学特性

目的:将抗人CD40单克隆抗体5C11与3种含有不同反应基团的聚合胶束(polymeric micelle,PM)偶联,构建相应5C11偶联的聚合胶束(5C11 coupled polymeric micelle,PM-5C11),筛选出其中最适合与5C11偶联的PM,并观察该偶联物的生物学特性。方法:分别合成3种不同化学结构的聚合物材料,制备相应PM,与5C11偶联后制备PM-5C11,选择其中偶联率和生物安全性均较高的作为最适PM-5C11。将最适PM-5C11与人Burkitt淋巴瘤Daudi细胞株作用,观测其生物学活性及其被Daudi细胞摄取的能力。结果:成功制备了分别含对甲苯磺酸酯基、丙烯基、羧基的3种PM,其中含对甲苯磺酸酯基和羧基的PM与5C11的偶联率均明显高于含丙烯基的PM的偶联率[(28.08±2.24)%、(29.06±1.37)%vs(21.26±1.04)%,P<0.05];由于含羧基的PM在制备过程中易残留细胞毒性物质,故选取含对甲苯磺酸酯基的PM作为最适PM。相应的最适PM成功偶联5C11形成PM-5C11,最适PM-5C11显示出5C11原有的生物学活性,并且可被Daudi细胞摄取。结论:构建的3种PM中,含对甲苯磺酸酯基的PM在生物安全性、偶联率及相应PM-5C11的生物学活性方面最优,可作为构建纳米药物载体的最佳选择。

IL-21 DNA微球疫苗的制备及其对CTL细胞抗肿瘤作用的影响

目的探讨聚丙烯酸树脂包裹白介素21DNA核酸疫苗免疫Babl/c小鼠的作用,检测小鼠CTL细胞抗daudi细胞的作用。方法采用乳剂—溶剂挥发法制备微球疫苗,分组免疫BALB/c小鼠,将制备所得的抗Daudi细胞肿瘤特异性CTL细胞作用于Daudi细胞,通过MTT法计算Daudi细胞增值抑制率,流式细胞仪测量Daudi细胞凋亡率,检测CTL细胞的杀伤作用。结果光学显微镜观察微球疫苗粒径约为(50.6±12.2)μm,且微球疫苗组对Daudi细胞的杀伤作用明显高于核酸疫苗单独免疫组。结论聚丙烯酸树脂能有效地保护核酸疫苗,并能提高其在细胞内的表达,为肿瘤疫苗的后续研究提供了思路和理论依据。