龟甲胶、鹿角胶调控MKK基因表达促进豚鼠OA软骨细胞增殖的研究

目的通过观察龟甲胶、鹿角胶含药血清对豚鼠膝骨关节炎软骨细胞增殖及其丝裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)基因表达的影响,探讨龟甲胶、鹿角胶对膝骨关节炎的治疗机制。方法采用Ⅱ型胶原酶消化法获取3月龄豚鼠膝关节软骨细胞,建立体外培养系,将龟甲胶组、鹿角胶组、盐酸氨基葡萄糖组、对照组4组含药血清分别对其进行干预,采用MTT法检测含药血清干预后软骨细胞增殖情况,荧光定量PCR检测含药血清干预对软骨细胞MKK基因表达的影响。结果 5%含药血清干预72 h后,软骨细胞的MTT的检测结果为龟甲胶组(0.315±0.048)、鹿角胶组(0.236±0.029)、盐酸氨基葡萄糖组(0.190±0.022)、对照组(0.146±0.023),差异有统计学意义(P<0.05);荧光定量PCR检测MKK表达量结果为龟甲胶(3.287±0.675)、鹿角胶(2.147±0.204)、盐酸氨基葡萄糖组(1.137±0.123)及对照组(0.627±0.102),差异有统计学意义(P<0.05)。结论龟甲胶、鹿角胶对软骨细胞的促增殖作用强于盐酸氨基葡萄糖,这一作用可能与其能有效上调关节软骨细胞MKK的基因表达有关。

中药复方鹿角胶丸防治绝经后骨质疏松症的机制研究

目的探索中药复方鹿角胶丸防治绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)的潜在研究。方法动物分A组:正常组(Sham组);B组:模型空白组(OVX组);C组:中药复方组:高、中、低3个剂量组(鹿角胶丸组,C1:LJJW-H、C2:LJJW-M、C3:LJJW-L组);D组:中药对照组(仙灵骨葆组,XLGB组);E组:西药对照组(福善美组,FSM组)。双能X线(DEXA)、micro-CT检测大鼠OVX模型骨密度及微结构的改变;HE染色检测骨小梁结构改变;ELISA法检测骨代谢相关指标的改变;Western blot及免疫组化检测成骨及破骨相关蛋白改变。结果DEXA显示,与OVX组相比,LJJW-M能够明显恢复大鼠的骨密度(P=0.037<0.05)。HE染色显示,与OVX组相比,LJJW-M能够明显恢复大鼠的骨小梁百分比(P=0.031<0.05),ELISA显示LJJW-M能够提高血清中PINP的含量(P=0.018<0.05),同时降低β-CTX的含量(P=0.026<0.05)。micro-CT显示LJJW-M能够明显改善骨的微结构(P=0.016<0.05),免疫组化及免疫印迹结果显示,LJJW-M能够促进调节骨形成的关键蛋白Runx 2(P=0.023<0.05)和促进骨吸收的关键蛋白Cathepsin K(P=0.013<0.05)。结论中药复方鹿角胶丸通过促进成骨和抑制破骨的双重作用防治PMOP。

鹿角胶临床应用及其用量探究

通过搜集古医籍及现代医家临证经验及临床应用,总结出鹿角胶具有以下临床应用特点:鹿角胶汤剂临床用量范围为6~41.4 g,其中常用剂量为6~15 g,丸散剂临床用量范围为1.08~16 g。结合病种、证型、症状选择其最佳剂量,如补益肝肾、益精养血治疗强直性脊柱炎、不孕症、骨质疏松、骨折等,常用量为6~41.4 g,丸散剂用量为1.08~16 g;温阳散寒治疗肩周炎、系统性硬化病、皮下脂肪瘤等,常用量为5~12 g。根据病种、证型及症状,配伍相应中药,如补益肝肾、益精养血常配伍龟板胶、山萸肉、熟地黄、巴戟天、仙灵脾等;温阳散寒常配伍熟地黄、炮姜、白芥子、肉桂等。

超高效液相色谱-串联四极杆质谱法同时检测鹿角胶饮片中牛皮源、驴皮源及鹿角胶成分

目的建立鹿角胶饮片中牛皮源、驴皮源及鹿角胶成分同时检测方法。方法精密称定鹿角胶饮片粉末0.1 g,加1%碳酸氢铵溶液超声溶解、稀释、过滤,用胰蛋白酶酶解12小时,利用超高效液相色谱-串联质谱联用技术(UPLC-MS/MS)和多反应监测模式(MRM)分别检测黄明胶特征肽段离子对(m/z)641.3→726.2,783.3,阿胶特征肽段离子对(m/z)539.8→612.4,924.0,鹿角胶特征肽段离子对(m/z)765.4→554.0,733.0。色谱柱为BEH-C18,以乙腈—0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。分别考察上述三种特征肽段离子对的专属性,并用逐级稀释法确定方法检出限。用所建方法检测10批市售鹿角胶饮片。结果黄明胶、阿胶、鹿角胶三种对照药材在所建方法下保留时间分别为3.6分钟、6.2分钟和10.9分钟,无基质干扰,检测限分别为0.1,2.0,1.0 mg/L,对照药材混合溶液进样6次,鹿角胶峰面积RSD为2.1%,黄明胶峰面积RSD为3.7%,阿胶峰面积RSD为2.8%,方法重复性良好。将所建方法应用于10批市售鹿角胶饮片的检测分析,1批结果为不合格(检出牛皮源成分)。结论所建方法专属性强、灵敏度高,实现了鹿角胶饮片中主成分鉴别与非法添加成分检查的同时检测,进一步提高检验效率,可有效控制鹿角胶质量。

岳甫嘉男科种子方剂鹿角胶配伍研究

岳甫嘉种子方中鹿角胶的配伍应用灵活而多端,其选药配伍的宗旨是以补肾中生殖之精为核心,通过配伍其他类动物药以强化补肾生精,配伍"柔剂阳药"使补中寓通,配伍归心药物,使心肾相交,配伍理气健脾之品,使脾肾相资,配伍补血活血之药,使精血互生,配伍清热坚阴之品,使补而不热,配伍固精之品,使补中兼固。熟练掌握岳甫嘉鹿角胶种子方的配伍核心思想及思路为目前男性不育症的中医药治疗可以提供优化的治疗方案。

超高效液相色谱-三重四级杆质谱法检测乌鸡白凤丸中鹿角胶特征肽及牛皮源成分

目的:建立含胶类中药乌鸡白凤丸中鹿角胶特征肽及可能掺杂的牛皮源成分的专属性检查方法。方法:利用胰蛋白酶对乌鸡白凤丸中所含的胶类特征肽进行酶解,采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱,选择鹿角胶特征分子离子峰m/z 765.4(双电荷)→554.0、733.0及牛皮源特征分子离子峰m/z 641.3(双电荷)→726.2、783.3作为检测离子对,ESI+离子化模式,进行多反应监测模式检测。结果:5批乌鸡白凤丸样品均检出了鹿角胶的特征肽段,且均未检出牛皮源成分。结论:该检测方法专属性强、准确、可靠,可用于乌鸡白凤丸中鹿角胶特征肽及牛皮源成分的检测。

超高效液相色谱-质谱法同时检测龟鹿补肾丸中龟甲胶、鹿角胶成分

建立检测龟鹿补肾丸中龟甲胶、鹿角胶成分的超高效液相色谱-质谱方法。恒温酶解样品中的胶类特征性肽段,采用超高效液相色谱-质谱识别技术分别对龟甲胶和鹿角胶进行鉴别,ESI+电离模式进行多响应监测。结果表明,本方法重复性好,精密度和稳定性考察RSD均小于6.0%,龟甲胶及鹿角胶检出限分别为0.02 mg/mL和0.01 mg/mL。用建立的检测方法测定6批次龟鹿补肾丸样品,均检测出了龟甲胶及鹿角胶特征性成分。说明该方法简便准确,灵敏度高,适用性强,可为龟鹿补肾丸中胶类成分的质量管控提供依据。

超高效液相色谱-三重四极杆质谱法用于中成药中胶类成分的检测研究

目的建立含中成药中胶类药材的检测方法。方法采用胰蛋白酶对中成药样品酶解处理,利用超高效液相-三重四极杆质谱(RRLC-QQQ)对处方中阿胶、黄明胶、龟甲胶、鹿角胶的专属性特征离子进行检测。结果方法的专属性、精密度和灵敏度均符合分析检测的技术要求。部分样品检测到了处方中规定的胶类药材成分,有的样品未检测到处方规定的胶类药材成分,而检出了处方中不应有的其他胶类成分。结论所建立的方法经方法学验证,专属性强,为含胶类药材的中成药的质量控制及标准研究提供了参考。

UPLC-QTOF-MS结合主成分分析法用于龟甲胶、鹿角胶中添加牛皮源成分的检测研究

目的:建立龟甲胶、鹿角胶中非法掺入牛皮源成分的检测方法。方法:采用胰蛋白酶对龟甲胶、鹿角胶、牛皮源成分进行酶解,利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)进行测定,采用Markerlynx软件对3种胶类的液质数据进行主成分分析,找出鉴别牛皮源成分的专属性特征肽段,并对特征肽的序列进行确认。结果:对19批样品进行检测发现,其中8批龟甲胶及8批鹿角胶中可检出牛皮源成分的特征肽段。结论:所建立的方法经验证,专属性较强,可用于龟甲胶、鹿角胶中非法掺入牛皮源成分的检测。

超高效液相色谱-三重四极杆质谱法用于阿胶、龟甲胶、鹿角胶中猪皮源成分的检测

目的:建立超高效液相色谱-三重四极杆质谱法(UPLC-QQQ/MS法)测定阿胶、龟甲胶和鹿角胶中猪皮源成分。方法:采用胰蛋白酶进行酶解处理,色谱柱为ZORBAX SB-C18(2.1 mm×150 mm,5μm);以0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)为流动相,梯度洗脱(0~25 min,95%A→80%A;25~40 min,80%A→50%A),流速为0.3 mL·min^-1;电喷雾离子源(ESI),正离子模式下扫描,采用多重反应监测模式(MRM),对特征肽目标离子m/z 774.5(双电荷)→977.8和m/z 774.5(双电荷)→1034.6进行检测。结果:阿胶中新阿胶掺入量为1%~12%、龟甲胶中新阿胶掺入量为2%~11%、鹿角胶中新阿胶掺入量为3%~12%的范围内,掺入量与色谱峰面积成正比,线性方程分别为Y=4471X-29.00(r^2=0.9971),Y=4468X-63.33(r^2=0.9963),Y=4262X-74.48(r^2=0.9980)。检测下限浓度为0.1 g·mL^-1。5批阿胶、5批龟甲胶、5批鹿角胶中,有1批阿胶、1批龟甲胶、2批鹿角胶可疑样品中检出新阿胶。结论:所建立方法操作简便,专属性强,灵敏度高,重复性良好,可用于阿胶、龟甲胶和鹿角胶中掺伪成分猪皮源的检测。

基于“阳化气”理论研究鹿角胶对高脂血症大鼠代谢功能的影响

目的:基于“阳化气”理论研究鹿角胶对高脂血症大鼠代谢功能的影响。方法:将6周龄雄性SD大鼠随机分为正常对照组(C组)和高脂血症模型组(HFD组),C组用基础饲料喂养,HFD组用高脂饲料喂养,16周后检测血脂水平以判断是否造模成功。将造模成功高脂血症模型大鼠随机分为高脂血症模型对照组(H组)和鹿角胶组(HD组)。C组继续用基础饲料喂养;H组与HD组继续用高脂饲料喂养;HD组用鹿角胶溶液(0.2 g/mL)进行1.25 g/kg灌胃,每日1次。4周后,取材进行糖脂代谢和肝肾功能相关指标检测。结果:干预后,HD组血清血脂指标(TG、LDL-C)、肝功能指标(ALT、AST、TBIL、DBIL)和肾功能指标(UA、Scr)水平均显著低于H组(P<0.05,P<0.01)。结论:补阳药鹿角胶可能有改善高脂血症脂代谢和保护肝肾功能的作用。

龟甲胶和鹿角胶含药血清对豚鼠骨关节炎软骨细胞JNK及p38 MAPK基因表达的影响

目的:通过实验观察龟甲胶、鹿角胶含药血清对豚鼠膝骨关节炎软骨细胞促增殖作用以及两种含药血清对JNK及p38 MAPK基因表达的影响,揭示龟甲胶及鹿角胶治疗膝骨关节炎的作用机制。方法:分别用龟甲胶、鹿角胶、盐酸氨基葡萄糖(GHC)含药血清及生理盐水对3月龄豚鼠骨关节炎软骨细胞进行干预,MTT法比较含药血清对软骨细胞的促增殖情况,QPCR检测含药血清干预后软骨细胞JNK及p38 MAPK基因的表达情况。结果:用含药血清浓度为5%的各组培养液干预后(时间72h),龟甲胶组、鹿角胶组、氨基葡萄糖组和空白对照组MTT法检测OD值分别为0.468±0.017,0.425±0.010,0.337±0.017,0.276±0.027,结果显示差异有统计学意义(P<0.05)。QPCR检测龟甲胶组、鹿角胶组、盐酸氨基葡萄糖组和空白对照组JNK mRNA相对表达量分别为0.162±0.096,0.333±0.165,0.653±0.141,1.000±0.000,差异有统计学意义(P<0.05)。QPCR检测龟甲胶组、鹿角胶组、盐酸氨基葡萄糖组和空白对照组p38MAPK mRNA相对表达量分别为0.058±0.025,0.229±0.057,0.441±0.090,1.000±0.000,结果显示差异有统计学意义(P<0.05)。结论:龟甲胶和鹿角胶都能有效减少豚鼠骨关节炎软骨细胞JNK及p38 MAPK基因的表达,对软骨细胞作用为促增殖,对其凋亡产生抑制作用,从而一定程度上减缓骨关节炎的病损进展。

基于酶解法采用超高效液相色谱-串联质谱法检测阿胶、黄明胶、鹿角胶中猪皮特征肽

目的:建立基于酶解法采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS法)检测阿胶、黄明胶和鹿角胶中猪皮特征肽。方法:采用胰蛋白酶进行酶解处理;使用Xbridge BEH-C;色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.5μm),柱温30℃,以0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)为流动相,梯度洗脱(0~1 min,95%A;1~5 min,95%A→70%A;5~5.1 min,70%A→10%A;5.1~7 min,10%A;7~7.1 min,10%A→95%A;7.1~10 min,95%A),流速0.4 mL·min^(-1),进样量为2μL;电喷雾离子源(ESI^(+)),采用多重反应监测模式(MRM),正离子模式,对猪皮特征肽目标离子m/z 406.5(双电荷)→657.3和m/z 406.5(双电荷)→556.3进行检测。结果:阿胶、黄明胶、鹿角胶中分别掺入猪皮特征肽,质量浓度范围为5~500 ng·mL^(-1)时,测得浓度与色谱峰面积成正比,线性方程分别为Y=3.0204X+8.998(r;=0.9997),Y=3.1786X+11.9069(r;=0.9997),Y=3.0465X+6.879(r;=0.9986)。检测限为11 mg·kg^(-1),阿胶样品中猪皮杂质残留限值为76.7 mg·kg^(-1)。28批阿胶样品中,有2批样品中检出猪皮特征肽。6批黄明胶、6批鹿角胶中均未检出猪皮特征肽。结论:所建立方法灵敏度高,重复性好,操作简便快捷,专属性强,可用于阿胶、黄明胶和鹿角胶中掺假猪皮的检测。

鹿角类药材的活血祛瘀作用

鹿角类药材包括鹿角、鹿角胶和鹿茸,常用于治疗精神疲倦、腰膝酸痛、阳痿滑精、崩漏带下等虚弱性疾病。笔者通过查阅有关中医药典籍以及现代科学研究的结果,对鹿角类药材的功效进行分析。结果发现,鹿角类药材具有活血化瘀作用,现代实验和药理研究也可以论证这一观点的成立。并发现其活血祛瘀的机制可能跟其对雌激素的双向调节有关。