脱羰秋水仙碱(DM)辅助去牛卵母细胞核的研究

受体细胞去核是核移植关键步骤之一。利用脱羰秋水酰碱(Demecolcine,DM)显示牛卵母细胞染色体的位置进行去核,主要从以下几个方面进行了试验:卵母细胞在DM中孵育浓度、卵母细胞在DM中孵育时间及卵母细胞成熟时间对显示效果的影响。结果表明:(1)成熟牛卵母细胞用离子霉素激活5 min,DM孵育2 h完全诱导去核,结果没有见到完全去核的卵母细胞;(2)挑选有第一极体的成熟牛卵母细胞,在浓度为0.5μg/mL的DM中孵育2 h显示率可达76.54%;(3)牛卵母细胞在成熟18 h可以获得73.86%的显示效果。(4)在没有去卵丘细胞的卵母细胞中添加DM取得了更好的显示效果(80.82%),囊胚的发育率也较其它组高,可达18.60%,说明未去卵丘细胞的卵母细胞添加DM更有利于显示染色体的位置,而且更有利于囊胚的发育。利用DM显示染色体的位置不仅可以高效快速的去核,同时也避免了传统去核时荧光对卵母细胞的照射。

脱羰秋水仙碱诱导昆明白小鼠卵母细胞去核的研究

在已有的demecolcine(以下简称Deme)诱导去核技术路线的基础上,以昆明白小鼠卵母细胞为实验材料,对影响去核率的几个因素(包括Deme浓度、Deme处理起始时间和作用时间、卵母细胞的卵龄)逐次进行实验。结果表明:(1)激活卵母细胞在浓度为0 4μg/mL和0 5μg/mLDeme KSOM液中处理60min均能有效去核,但0 5μg/mL组获得更高的去核率(33 3%)。(2)卵母细胞在激活后0～5min之内迅速放入0 5μg/mLDeme KSOM液中,处理60～180min得到了相对较高的去核率(31 9%～24 5%)。(3)昆明白小鼠hCG注射后17～18h收集的卵母细胞更有利于Deme诱导去核,去核率为27 1%。经比较分析,建立了优化的Deme诱导去核程序。

梅花鹿-牛异种体细胞核移植操作方法的研究

本研究旨在对梅花鹿-牛异种体细胞核移植(Interspecies somatic cell nuclear transfer,ISCNT)的显微操作方法进行系统研究,从而优化其操作过程。以梅花鹿耳皮肤成纤维细胞为供核细胞,牛MⅡ期卵母细胞为受体,分别采用盲吸法、挤压法和脱羰秋水仙碱(Demecoline,DEME)化学辅助的方法去核,带下注射(Perivitelline microin—jection,PM)、Pizeo破膜细胞胞质内注射(Break—membrane-cell intracytoplasmic microinjection,BMCIM)和全细胞胞质内注射(Whole-cell intracytoplasmic microinjection,WCIM)的方法注核,带下注核的卵母细胞电融合后化学激活,其余方法注核后直接化学激活,重组胚用CR1aa培养液体外培养。结果表明:(1)DEME辅助法去核率最高,挤压法最低,3种去核方法的去核率差异显著(P<0.05),去核时间差异不显著(P>0.05);(2)PM组和WCIM组注核成功率分别为100.0%和94.8%,注核时间分别为31.0和35.1 s,显著低于BMCIM法(P<0.05),但是注核成功率显著高于BMCIM法(P<0.05),而且两者差异不显著(P>0.05);(3)BMCIM组和WCIM组的激活率均显著高于PM组(P<0.05),其中一步法的BMCIM组最高,一步法和两步法在激活率、卵裂率和囊胚率方面均无显著差异(P>0.05)。结果提示:DEME辅助去核、Pizeo辅助破膜胞质内注射的一步法显微操作可有效用于梅花鹿-牛的异种体细胞核移植的研究。