文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)多角体蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对文山松毛虫质型多角体病毒的增殖 ,纯化 ,获得一株单一类型的质型多角体病毒 提纯的病毒粒子经SDS 酚抽提 ,琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNA ,低熔点琼脂糖电泳法回收纯化编码多角体蛋白的第十片段S10 S10经DMSO变性 ,逆转录合成cDNA第一条链 ,PCR扩增后 ,克隆在PMD18 T载体上 ,克隆片段全长 76 3bp 起始密码AUG位于第 3～ 5位碱基 ,终止密码UGA位于第 74 7～ 74 9位碱基 推测DpwCPV多角体蛋白基因编码一段由 2 4 9个氨基酸组成的多肽 ,分子质量为 2 84 39.4 4× 10 3 与舞毒蛾质型多角体病毒 (LdCPV)多角体蛋白基因比较 ,两者核苷酸序列的同源性为 97% ,它们各自编码的多角体蛋白的氨基酸同源性为 99% ;与家蚕质型多角体病毒(BmCPV)多角体蛋白基因相比较 ,两者核苷酸序列的同源性为 88% ,它们各自编码的多角体蛋白的氨基酸同源性为 97%

文山松毛虫质型多角体病毒形态结构及理化性质的研究

对文山松毛虫质型多角体病毒的形态结构及理化特性进行了研究,多角体大部分为六边形,少数为四边形及近园形,其大小在0.47～2.45μ之间,平均为1.1μ。病毒粒子呈球形,无囊膜,致密的核芯区由一层外壳包裹,直径为60nm。病毒粒子表面有12个刺突,放大图象可见其亚单位排列。多角体蛋白的主要成分为一种,分子量为26200道尔顿,多角体蛋白氨基酸组成中不含半胱氨酸;其碱性氨基酸与酸性氨基酸之比为1:2.16。病毒粒子结构蛋白含五条多肽组分。用SDS-热酚法提取所得核酸,其热变性紫外吸收OD260值增加51.6％。抗核酸酶S1。Tm值为86℃。在1％琼脂糖凝胶电泳中可分为9个片段,而在5％PAGE中,则可分为10个片段。各片段大小在0.66×106～2.85×106道尔顿之间,总分子量为15.35×106。电镜分析研究显示了CPV RNA在0.4μ、0.8μ和1.2μ处有三个分布峰。

云南省松毛虫病毒资源及其应用

１９７８年以来，云南省从松毛虫自然感病虫尸中分离到６种病毒。于１９８４～１９９４年，先后应用推广松毛虫质型多角体病毒防治文山松毛虫、云南松毛虫及思茅松毛虫４２８２．３ｈｍ２，当年防效７０．０％～９２．８％，持续感染明显。文山松毛虫质型多角体病毒致病力强，毒力稳定，并具有继代感染的作用。

文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)NS5蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对文山松毛虫质型多角体病毒 (DendrolimuspunctatusWenshanensiscytoplasmicpoly hedrosisvirus,DpwCPV)的增殖、纯化 ,获得一株单一类型的质型多角体病毒。提纯的病毒粒子经SDS 热酚法抽提得到基因组dSRNA ,使用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化第九片段S9。S9RNA双链经高温变性 ,逆转录合成cDNA双链。根据DpwCPV与BmCPV 1的同源性设计引物 ,将S9进行PCR扩增后 ,克隆到PMD1 8 T载体上。最终获得一个 977bp的序列 ,其中包含一个 963bp的开放阅读框 (ORF)。推测DpwCPVS9基因编码一个 32 0个氨基酸的蛋白 ,分子量约为 35 5 60。

甜菜夜蛾增殖马尾松毛虫质型多角体病毒研究

以甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)作为替代宿主增殖马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)的研究结果表明,DpCPV在甜菜夜蛾体内连续传代3次后得到的DpCPV-Se3与DpCPV具有相同的电泳图谱;多角体和病毒粒子在电镜下观察,未发现形态上的明显变化.生测结果表明,DpCPV-Se3与DpCPV回接松毛虫试验,其半数致死浓度分别为0.92×103 PIB/mL和1.44×103PIB/mL,二者毒力差异不显著.以甜菜夜蛾增殖DpCPV,多角体产量达到2.34×108PIB/头.用DpCPV-Se3和DpCPV的S7和S10片段分别进行同源性序列分析,结果没有明显变化.认为利用甜菜夜蛾增殖DpCPV用于生物防治具有可行性.

马尾松毛虫质型多角体病毒S4的cDNA克隆及序列分析

从马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株中提取病毒核酸,回收、纯化第四片段S4,经RT-PCR扩增得到了S4的cDNA克隆并测定了其全序列。结果表明,S4全长由3262个碱基组成,包含一个编码1058个氨基酸的完整开放阅读框架。Blast同源分析显示,DpCPV s4与LdCPV S4、BmCPV S4和RRSV S2编码蛋白氨基酸的同源性分别为94％、92％和22％。另外,氨基酸序列部分区域与Methanosarcina mazei Goel的甲基化转移酶有同源性,且序列中含有鸟苷酸转移酶活性位点。

单引物法扩增马尾松毛虫CPV基因组第8片段及其序列分析

本文利用T4 RNA连接酶将5’-磷酸、3’-氨基修饰的引物1连接到马尾松毛虫质型多角体病毒第8片段dsRNA的3’-OH端。经逆转录、退火、补齐形成全长双链cDNA。使用单一的互补引物2进行PCR扩增。扩增产物克隆在pMDl8-T载体上。对重组子进行限制性内切酶分析及序列测定,结果表明,克隆片段全长330bp,S’端具有CPV-1型末端保守序列AGTAAA’端具有保守序列GTTAGCC。起始密码子从ATG位于38-40残基,终止密码子TAA位于1208～1210残基。推测S8片段编码390个氨基酸多肽。分子量为44kDa。与舞毒蛾质型多角体病(LdCPV)第8片段相比较,核苷酸和氨基酸同源性分别为97％和98％。与家蚕质型多角体病毒(BmCPV)第8片段相比较,核苷酸和氨基酸的同源性分别为83％和85％。与人的呼肠孤病毒第8片段比较没有明显的同源性。

不同治理区文山松毛虫自然种群生命表比较

文山松毛虫Dendrolimus punctatus wenshanensis Tsai et Liu在云南省是危害较为严重的害虫之一,文山松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimus punctatus wenshanensis Cytoplasmic Polyhedrosis Virus,Dpw CPV)制剂的应用为控制文山松毛虫的危害发挥了积极的作用。利用生命表技术来研究Dpw CPV施用区和化学药剂施用区文山松毛虫自然种群动态和发展趋势,结果显示:寄生是文山松毛虫蛹期的第一致死因子,捕食是其它发育阶段第一致死因子;在Dpw CPV施用区,文山松毛虫除卵期外的其他发育阶段,病毒是排在首位的微生物致死因子,云南松Pinus yunanesis林内的文山松毛虫种群趋势指数为0.61,预测下一代的种群呈下降趋势;在化学药剂施用区,文山松毛虫不同发育阶段的微生物致死因子各不相同,云南松林内的文山松毛虫种群趋势指数为1.82,预测下一代的种群呈上升趋势。研究结果为准确预测文山松毛虫种群变动规律,揭示Dpw CPV持续控制文山松毛虫危害的机制提供了科学数据支持。

替代宿主增殖松毛虫质型多角体病毒的比较研究

银纹夜蛾幼虫 (Argyrogrammaagnata)对松毛虫CPV(DpCPV)十分敏感 ,本文对两种不同的宿主增殖松毛虫CPV作了比较 ,电镜证实用替代宿主增殖的DpCPV与原毒株多角体 (CPB)和病毒粒子的形态完全一致。 3 %PAGE分析二者的RNA图谱基本一致 ,有大小相同的 2 .98× 10 6- 0 .6 6× 10 6道尔顿的 10条带 ,用它增殖的DpCPV(Aa DpCPV)对松毛虫有相当的毒力 ,每头 3龄幼虫病毒产量平均为 2 .5× 10 8CPB。

文山松毛虫质型多角体病毒杀虫剂的研制

报道了文山松毛虫质型多角体病毒杀虫剂的研制 ,包括多角体的纯化、辅助剂的筛选、剂型研制、产品包装以及病毒杀虫剂的产品质量检测及生产等。该杀虫剂为乳剂 ,多角体浓度达 2 .5×10 9PIB/mL ;所选辅助剂取材方便、容易配制 ,对环境没有污染。经安全检测证明 ,无致病菌 ,符合国家卫生标准 ,对试验动物小白鼠无毒性和致病性。生物测定用 1× 10 6PIB/mL感染 2龄文山松毛虫幼虫 ,其死亡率平均为 85 .5 %

马尾松毛虫质型多角体病毒在昆虫细胞系中的离体增殖研究

本文报道了马尾松毛虫质型多角体病毒（简称ＤｐＣＰＶ）在５株昆虫细胞系，即棉铃虫卵巢细胞系ＳＦＥ－ＨＡ－８３１与ＳＦＥ－ＨＡ－８２１２、家蚕细胞系Ｂｍ－Ｎ、粉纹夜蛾细胞系ＴＮ－３６８和草地贪夜蛾细胞系Ｓｆ－２１中的增殖。证明ＤｐＣＰＶ可在ＳＦＥ－ＨＡ－８３１、ＳＦＥ－ＨＡ－８２１２、ＴＮ－３６８和Ｓｆ－２１４株细胞系中增殖。其中ＳＦＦ－ＨＡ－８３１细胞能同时复制几种型混合的ＤｐＣＰＶ；细胞的感染率在２０％－３５％左右，每个感染细胞约可产生５０－１００个多角体；感染细胞己传代２０次以上；离体和活体增殖的病毒的形态、感染力和核酸带谱等特征均保持稳定。

松毛虫CPV-W1984株的遗传稳定性

自 1 98 3年起应用松毛虫 CPV-W1 984在云南、四川、河南、广西等地防治文山松毛虫、德昌松毛虫、马尾松毛虫等主要害虫防治面积累计达 6.7万 hm2 ,效果显著。为了研究该病毒株在不同自然条件下不同的宿主松毛虫体内连续增殖后的遗传稳定性 ,作者电镜观察了三种病毒样品 ,其多角体形态大小一致 ,3 %和 5 % PAGE分析各样品的基因组RNA,结果表明该毒株在野外长期使用过程中 ,除保持稳定的毒力外 。

马尾松毛虫核型多角体病毒粒子的SERS谱研究

获得并研究了马尾松毛虫核型多角体病毒粒子在银胶中的表面增强拉曼散射（ＳＥＲＳ）谱。ＳＥＲＳ谱的增强特性与ｐＨ值有关，其ＳＥＲＳ谱在ｐＨ＝８时获得了最好的增强。该病毒粒子是通过其衣壳蛋白的ＣＯＯ－和ＮＨ２基因吸附在银表面上，色氨酸（Ｔｒｐ）和酪氨酸（Ｔｙｒ）残基侧链远离银表面，酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ的谱带在ＳＥＲＳ谱中未出现，增强机制以化学增强为主。

三种微生物杀虫油烟剂成烟后菌体活性的测定

本研究通过电子显微镜扫描和菌体活性测定三种微生物杀虫油烟剂成烟后菌体的活性,结果表明:使用烟雾机分别施放白僵菌、苏云金杆菌和松毛虫质型多角体病毒三种微生物杀虫油烟剂,其成烟后,三种菌体能保持原来的形态和活性,白僵菌孢子能正常萌发,苏云金杆菌芽孢在营养琼脂上能形成晶体,松毛虫质型多角体病毒能有效地感染松毛虫,为进一步研究常规和应急防治松毛虫的简单易行、高效的使用方法提供技术依据。

马尾松毛虫质多角体病毒NS5蛋白的表达和功能初步分析

马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株第9个片段编码非结构蛋白NS5,利用pET-32a(+)载体带有组氨酸标记的重组蛋白进行表达,获得纯化的重组蛋白。利用凝胶电泳阻滞检测试验(EMSA)检测蛋白和核酸的结合作用,结果表明NS5蛋白能与病毒基因组dsRNA结合。

文山松毛虫质型多角体病毒在Sf21细胞中离体增殖试验

研究了文山松毛虫质型多角体病毒 (DpCPV W )在Sf2 1细胞中的离体增殖行为 ,并进行了空斑试验 ,结果显示DpCPV W毒株能够在Sf2 1细胞中增殖 ,也能在Sf2 1细胞上形成空斑 ,并能产生形态正常的病毒多角体。在DpCPV W中加入基因工程增效蛋白 ,能显著增加病毒粒子对离体细胞的感染率 ,增幅达 145 %。生物测定表明 ,离体增殖的病毒多角体与虫体增殖的多角体的毒力相当。因此 ,Sf2 1细胞可以作为文山松毛虫CPV增殖行为研究的离体细胞系统 。

影响DpCPV杀虫剂高产条件的研究

DpCPV杀虫剂的产量不仅受到气候、环境等因素的影响,而且严重受到生产工艺技术水平的制约.针对DpCPV杀虫剂生产过程中工艺技术问题,我们对马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株在室内、室外和林间大量增殖中的集虫虫质、接种浓度、频率、收获时间等及其相互间的关系进行了详细研究,得出在DpCPV杀虫剂生产过程中接种1×107CPB/mL病毒浓度为宜,接种虫龄以4～5龄虫为宜,收获病毒时间13～14d为宜.其室外单虫病毒产量平均可达到7.5×108CPB,比国内报道要高.研究结果对DpCPV杀虫剂的高产增殖有很强的指导意义.

Bt—DCPV复合微生物杀虫剂防治文山松毛虫试验

经Bt 2× 10 7、 4× 10 7、 6× 10 7、 8× 10 7、 1× 10 8孢子 /mL5种浓度对 4龄文山松毛虫的室内生测 ,筛选出松毛虫死亡率达 70 %的最佳浓度为 2 0× 10 7孢子 /mL ;以此浓度的Bt与DCPV复配试验 ,选择残存虫DCPV感染率 5 0 %的DCPV最低浓度为 6 0× 10 5PIB/mL。林间应用最适的Bt +DCPV复配浓度是 6 0× 10 7孢子 /mL +4 0× 10 5PIB/mL ,其防治效果为 82 0 8%。

松毛虫质型多角体病毒悬浮剂防治马尾松毛虫田间药效实验

本实验主要研究20亿PIB/mL松毛虫质型多角体病毒悬浮剂防治马尾松毛虫田间药效。实验结果表明:松毛虫质型多角体病毒的致死速度与其剂量有关,在500倍液剂量处理区,在1周内的死亡率达到67.6%,各试剂量区均有明显的持效性。第15天的防效效果为83.5%~90.4%;第30天的防效为85.6%~95%;松毛虫质型多角体病毒1000倍液剂量与500倍液剂量区与Bt区防治效果差异显著。

基于DpwCPV的松毛虫生物防治模式研发

文山松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimus punctatus wenshanensis Cytoplasmic Polyhedrosis Virus,Dpw CPV)制剂的应用为控制松毛虫危害发挥了积极作用。本研究基于DpwCPV制剂,在云南弥勒市1 000 hm^2松林分别实施了3种松毛虫生物防治模式,经过1 a的综合应用,示范区松毛虫虫口数量相比治理前下降了59.1%。结果表明,基于DpwCPV制剂的3种生物防治模式具有方便、易操作的特点,可在松毛虫生物治理中广泛推广。