精液优化处理后DNA碎片指数与IVF-ET胚胎质量及妊娠结局的关系

目的:评估经密度梯度离心联合上游法优化处理后的精子DNA碎片指数(DFI)与辅助生殖体外受精-胚胎移植(IVF-ET)胚胎质量及妊娠结局的关系。方法:回顾性分析2022年4月至12月在郑州大学第一附属医院生殖医学中心因单纯输卵管因素行IVF-ET的257个周期,比较男方精液优化前后精液参数和精子DFI;按优化后精子DFI将其分为高DFI组(DFI>5)与低DFI组(DFI≤5),比较两组的胚胎发育及妊娠结局;根据临床妊娠情况分为妊娠组与非妊娠组、持续妊娠组及早期流产组,比较精子DFI情况。结果:与处理前相比,精液优化处理后前向运动精子及正常形态精子百分比提高,精子DFI下降(P<0.001)。精子优化处理后高DFI组的早期流产率高于低DFI组(P<0.05)。105例临床妊娠周期中早期流产组精液优化处理前、后DFI均高于持续妊娠组(P<0.05)。结论:密度梯度离心联合上游优化处理是一种有效的精液制备方法,可提高精子前向运动能力和正常形态精子比例,降低精子DFI;优化后精子高DFI可能增加临床妊娠后早期流产的风险。

浮游板优化精液与密度梯度离心结合上游法的比较

目的应用浮游板和密度梯度离心结合上游法优化人类精液,明确优化效果并比较两种方法优化后精子参数的差异。方法收集正常精液样本85例和轻中度少弱精子症精液样本59例,每例样本分为原液组、密梯组和浮游组各1 ml进行后续处理。原液组在精液液化后未做任何处理;密梯组精液液化后用密度梯度离心法结合上游法进行处理,浮游组则在精液液化后应用精子浮游板进行处理。比较原液组、密梯组、浮游组3个亚组间的精子浓度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率;应用流式细胞仪检测精子线粒体膜电位和精子DNA碎片指数,使用单精子活性氧分析仪检测单精子活性氧水平,使用电子显微镜观察精子超微结构并进行组间比较。结果无论是正常精液还是轻中度少弱精子症精液,与原液组比较,密梯组与浮游组的前向运动精子百分率、正常形态精子百分率及精子线粒体膜电位均显著升高(P<0.05),精子DNA碎片指数显著降低(P<0.05);密梯组和浮游组各指标无显著性差异(P>0.05)。正常精液中,浮游组的精子浓度显著高于密梯组(P=0.029),单精子活性氧水平显著低于原液组(P=0.038)。轻中度少弱精子症精液中3亚组间的单精子活性氧水平均无显著性差异(P>0.05)。电子显微镜观察发现正常精液中3个亚组的精子均未见明显异常;轻中度少弱精子症精液中密梯组部分精子可观察到精子细胞膜断裂和线粒体肿胀等异常,而浮游组精子超微结构未见明显异常。结论密度梯度离心结合上游法和浮游板法用于精液的处理和优化,均可有效回收活力、形态和功能更好的精子。精子浮游板法的体外干预小,操作简便,可以获得活性氧更少、损伤更小的精子。

大鼠骨髓单个核细胞诱导扩增为内皮祖细胞的细胞分离方法、接种数目、培养瓶包被条件

目的筛选大鼠骨髓单个核细胞(BMMNCs)诱导扩增为内皮祖细胞(BM-EPCs)的细胞分离方法、接种数目、培养瓶包被条件,构建一个高效、高产量、高纯度的骨髓来源BM-EPCs分离培养诱导扩增方法。方法取2周龄雄性SD大鼠,脱颈处死后分离大鼠双侧胫骨和股骨,收集骨髓细胞悬液。配制30%、50%、60%和70%浓度的Percoll细胞分离液,通过Percoll密度梯度离心法分离出大鼠BMMNCs种子细胞,并计算活细胞比例。将获得的BMMNCs分为1×10^(5)、5×10^(5)、1×10^(6)、2.5×10^(6)、5×10^(6)、1×10^(7)六个组别,分别接种于25 cm^(2)无菌培养瓶中,培养7 d后镜下观察各组细胞集落形成数目,并计算每10^(6)细胞的集落形成数。运用Graphpad prism9.5软件进行Logistic拟合曲线,根据相关系数R^(2)确定相关性,根据其P值将有统计学差异的接种数目纳入范围,随后使用R语言编程定义计算函数,根据已知种子细胞总数及相关性函数限制下,通过迭代寻找最佳的BMMNCs细胞接种数目。分别配制20、50、100 nmol/L浓度的人纤连蛋白(FN)溶液,以不添加FN的空白溶液为对照,分别包被空白培养瓶2、6、12、24 h,将收集的48 h未贴壁BMMNCs接种于FN包被的各培养瓶中,静置培养3 d后计算各组集落形成数目,确定FN包被的最佳浓度与时间。接种48 h未贴壁BMMNCs于25 cm^(2)培养瓶底,使用EGM-2完全培养基定向诱导,于显微镜下观察集落形成及诱导扩增进程。取培养14 d的BM-EPCs,分别采用双阳性染色法和流式细胞术鉴定BM-EPCs的纯度。结果使用Percoll分离法可把BMMNCs细胞清晰的分为5层,其中30%与50%Percoll细胞分离层之间为BMMNCs活细胞比率最高。BMMNCs的最优接种数目为2.5×10^(6)个。以50 nmol/L的FN溶液包被24 h或以100 nmol/L的FN溶液包被6 h皆可有效促进细胞集落形成。细胞接种7 d后获得形态良好的铺路石样细胞并建立生长优势,表明BMMNCs已经诱导成为形态良好的BM-EPCs。Dil-Ac-LDL/FITC-UEA-1双阳性细胞占比为91.89%±5.77%,CD31+KDR阳性率为90.73%±0.61%、CD14阳性率为0.53%±0.17%、CD45阳性率0.77%±0.34%,说明获得的BM-EPCs纯度良好。结论大鼠BMMNCs诱导扩增为BM-EPCs过程中,可使用Percoll密度梯度离心法分离BMMNCs,BMMNCs的最优细胞接种数目为2.5×10^(6)个,细胞培养瓶包被条件为以50 nmol/L的FN溶液包被24 h或以100 nmol/L的FN溶液包被6 h,分离培养诱导获得的BM-EPCs形态和纯度均良好。

不孕症患者宫腔内人工授精精子优选方法分析

目的:比较分析精子不同优选方法与宫腔内人工授精(IUI)成功率的相关性,以提高IUI妊娠率。方法:回顾性分析本院生殖中心门诊不孕症患者452例671个IUI周期,按精子优选方法分为3组:含5%人血清白蛋白(HSA)的Earle's液上游法、SpermR inse上游法、SupraSperm密度梯度离心法。比较各组患者的处理前后精子密度与活动率及临床妊娠结局。结果:3种精子优选方法处理后精子活动率及a+b级精子百分率显著增加(P<0.01)。含5%HSA的Earle's液上游法221个IUI周期,妊娠21个周期,周期临床妊娠率9.5%;SpermR inse上游法215个IUI周期,妊娠34个周期,周期临床妊娠率15.8%,与含5%HSA的Earle's液上游法比较有显著性差异(P<0.05);SupraSperm密度梯度离心法235个IUI周期,妊娠34个周期,周期临床妊娠率14.5%,与含5%HSA的Earle's液上游法比较无统计学差异(P>0.05)。结论:SpermR inse上游法的IUI临床妊娠率明显高于含5%HSA的Earle's液上游法,适用于各类不孕症患者。SupraSperm密度梯度离心法也具有较高的周期临床妊娠率,洗涤效果好,操作便捷高效,尤其适用于含炎症细胞、死精子和畸形精子等不良成分较多的精液。

两种方法处理后精子形态的变化

目的研究上游法和密度梯度离心法(Percoll法)处理前后精子畸形率的改变。方法60例精液标本分别行上游法和密度梯度离心法优选,处理前后均行精子形态改良巴氏染色分析。结果上游法和密度梯度离心法都可以显著降低精子的畸形率,上游法以颈部和尾部畸形最为明显,其他畸形降低不显著;而密度梯度离心法处理后精子以大头和双头畸形降低较为显著,其他种类畸形精子率下降不显著。结论上游法和密度梯度离心法对改善精子畸形率的作用有限。

大鼠MSCs的体外分离、培养及鉴定的实验研究

[目的]体外分离、培养及鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)。[方法]密度梯度离心法体外分离、培养7周龄SD大鼠MSCs,利用差速贴壁原理纯化MSCs,并通过形态学观察、细胞表面抗原标志物、多细胞系诱导分化对其进行鉴定。[结果]第3代(P3代)不表达抗原CD34,表达抗原CD44,符合MSCs表面标志物特征。[结论]密度梯度离心法能够建立稳定的MSCs体外分离培养体系。

两种精子优选法对正常形态活动精子回收率的对比研究

目的:探讨两种精子优选法对正常形态活动精子回收率的对比情况。方法:选取我院生殖中心门诊就诊的50例正常精液样本作为研究对象,每份标本分成上游法组和PureSperm法组,观察两组精子优选法优选后精子运动参数、回收效果以及回收率。结果:上游法和PureSperm法其优选后a级精子率、a+b级精子率、VCL、VSL、VAP、ALH、BCF、LIN、WOB、STR等指标均明显优于优选前(P<0.05),但两组优选法后精子运动参数比较均无统计学差异(P>0.05);优选后上游法和PureSperm法其密度、活力、头部、中段和尾端畸形率、SDI均明显优于优选前(P<0.05),其中PureSperm法优选后密度明显高于上游法,但活力明显低于上游法(P<0.05),活力、头部、中段和尾端畸形率、SDI等两种优选法比较无统计学差异(P>0.05);PureSperm密度梯度离心法a级活动精子和a+b级活动精子和正常形态活动精子回收率明显高于上游法(P<0.05),差异有统计学意义。结论:两组精子优选法均可获得较好的优选精子,PureSperm密度梯度离心法的精子回收率更高,但活力较低。

直接贴壁法体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞

取90gSPF级SD大鼠的双后肢骨髓,分别使用直接贴壁法和密度梯度离心法获得大鼠骨髓单个核细胞,用内皮培养体系EGM-2培养基进行定向诱导分化7~14d获得大鼠内皮祖细胞。免疫荧光染色和细胞功能学鉴定内皮祖细胞,观察内皮祖细胞出现的时间和数量,CCK-8法鉴定细胞的增殖能力。与密度梯度离心法相比,直接贴壁法在内皮祖细胞出现的时间、数量和增殖能力差异有统计学意义（P〈0.01）。因此,相对于密度梯度离心法,直接贴壁法培养出的内皮祖细胞分化时间更短、数量更多且增殖能力更强。

新城疫病毒纯化方法的比较研究

为了比较研究红细胞吸附释放法、PEG-6000沉淀法和超速离心法对新城疫病毒的纯化效果,将含有NDV的鸡胚尿囊液分别用上述3种方法处理,并测定血凝（HA）效价。结果表明,红细胞吸附释放法中采用50%的醛化红细胞纯化病毒效果最佳;PEG-6000沉淀法中,用9%的PEG-6000加1%NaCl处理病毒后再沉淀2-4 h效果最佳;采用超速离心法纯化的病毒主要分布在40%和50%蔗糖区带之间。3种方法比较,以超速离心法效果最好,红细胞吸附释放法和PEG-6000沉淀法纯化效果差异不大。

梯度离心在体外处理精子结合抗体中的应用

目的:比较单纯PureSperm方法和PureSperm联合上游法处理精子结合抗体阳性精子的效果。方法:采用单纯梯度PureSperm及PureSperm联合上游法处理精子结合抗体阳性的精子,比较2种处理方法处理后精子结合抗体消退情况。结果:2种方法处理后,精子结合抗体滴度较处理前降低(P<0.01);梯度PureSperm联合上游法处理后,精子结合抗体滴度的下降较单纯PureSperm方法更显著(P<0.05)。结论:采用梯度PureSperm离心或梯度PureSperm离心联合上游法处理精液,可以提高精子质量,再行宫腔内人工授精可能提高免疫性不育的治疗效果。

免疫磁珠法及密度梯度离心法分离纯化人外周血中性粒细胞的比较

目的比较免疫磁珠法和密度梯度离心法分离纯化人外周血中性粒细胞的可靠性。方法用免疫磁珠法和密度梯度离心法分别分离中性粒细胞,使用血球计数仪结合显微镜鉴定细胞纯度、回收率,以台盼蓝检测细胞活力。结果免疫磁珠法与密度梯度离心法分离中性粒细胞纯度分别为(98.76±0.53)%,(92.34±1.57)%,回收率分别为(90.01±2.24)%和(82.20±2.17)%,两种方法分离后中性粒细胞活力分别为(95.60±2.30)%,(94.20±3.11)%。结论免疫磁珠法分离人中性粒细胞纯度及回收率均好于密度梯度离心法,但分离后细胞活性二者差异不大。

骨髓间充质干细胞及其来源的微泡在慢性肾衰竭中的修复机制

目的:探讨骨髓间充质干细胞及其来源的微泡制备方法及在慢性肾衰竭中的修复机制,为慢性肾衰竭治疗提供方法。方法:①骨髓间充质干细胞制备。选择2只SD大鼠,取大鼠胫骨、股骨髓,利用密度梯度离心法完成单一核细胞分离,采用贴壁方法完成细胞的培养,采用流式细胞仪制备细胞表面特异性抗原,完成细胞的鉴定。②慢性肾衰竭模型制备及处理方法。选择2015年5月～2016年3月医院实验室进行试验的SD大鼠40只,取10只大鼠设为空白对照组,30只大鼠采用肾切除六分之五合并高盐饮食三个月方法建立大鼠慢性肾衰竭模型,随机数字法分为阳性对照组(n=10)、干细胞组(n=10)及微泡干预组(n=10)。阳性对照组建模成功后不采取任何措施处理,干细胞组建模成功后采用移植制备的骨髓间充质干细胞进行治疗,微泡干预组移植骨髓间充质干细胞后采用超声微泡辐照,比较不同组大鼠慢性肾衰竭修复效果。结果:①细胞换液一次细胞纯化呈梭状、纺锤状,以旋涡方式生长,细胞贴壁后生长迅速,细胞传代一次需要3 d,经过三代培养后细胞数量相对较多;②流式细胞仪测定结果表明:对照组细胞表面CD29几乎不表达,而MSC细胞表面CD29阳性率为91. 54%,符合骨髓间充质细胞表面特征;③Western blot法结果表明:HGF蛋白在4组相对分子量为82 000部位存在特异性条带,而EGF蛋白则在4组相对分子量为5 500部位存在特异性条带;④微泡干预组TNF-α水平低于干细胞组与阳性对照组(P<0. 05),微泡干预组细胞黏附分子1水平高于干细胞组与阳性对照组(P<0. 05);⑤阳性对照组建模后未经任何处理,肾脏损伤明显,存在大量炎性细胞;空白对照组未参与建模,肾脏组织完整,未见肾脏组织损伤,干细胞组修复30 d后肾脏损伤缓解,仍存在少许炎性细胞,微泡干预组修复后30 d肾脏组织损伤改善,未见炎性细胞。结论:采用全骨髓法能分离培养骨髓间充质干细胞,将频率为1 MHz、强度1. 0 W/cm2脉冲超声辐照微泡用于慢性肾衰竭大鼠骨髓间充质干细胞修复中能抑制炎性反应。

密度梯度离心联合上游法的精液处理在供精体外受精胚胎移植中的应用

目的:观察供精体外受精-胚胎移植术(D-IVF)中采用密度梯度离心法联合上游法处理精液后的胚胎情况。方法:回顾本院2013年1月-2014年7月D-IVF 135个周期,观察冷冻精液复苏后经采用密度梯度离心法联合上游法处理后精子总活动率、前向运动精子活动率等精液情况,以及受精以后的受精率、卵裂率、临床妊娠率,对照组为同期46个因丈夫梗阻性无精行ICSI的周期。结果:处理后精子总活动率、前向运动精子活动率均大大提高,但是精子密度却大大下降,处理前后比较差异均有统计学意义(P<0.05);受精以后的实验室资料和对照组比较,各项参数差异无统计学意义(P>0.05)。结论:密度梯度离心法联合上游法的精液处理方法在D-IVF中是一种稳定可行的方法。

探讨鼠胚实验中两种精子处理方法对实验结果影响

目的通过观察和比较两种精子的处理方法对昆明小鼠鼠胚实验结果的影响,探讨并建立适合鼠胚实验的精子处理方法。方法手术获取昆明小鼠卵子与精子进行常规体外受精,实验精子处理分别采用常规处理法或单密度梯度离心法。常规体外受精后培养至第5天,观察其受精率、卵裂率、囊胚形成率。结果采用单密度梯度离心法处理后的受精率、卵裂率及囊胚形成率,分别为96.2%、97.7%、86.8%,常规处理法为55.1%,84.5%,56.8%,两种方法比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论昆明小鼠鼠胚实验采用单密度梯度离心法处理后行常规体外受精,能明显提高受精率、卵裂率及囊胚形成率。

脂肪干细胞分离纯化方法研究进展

脂肪干细胞作为种子细胞广泛应用于组织工程中,而获得足够量的、活性高的、高纯度的脂肪干细胞是其在组织工程中应用的前提。本文综述近几年来脂肪干细胞分离纯化方法的研究进展,比较各方法的优缺点,为分离纯化出理想的脂肪干细胞提供理论依据。

两种精子优化法对精子动态、形态的影响比较

目的探讨上游法和密度梯度离心法处理精液前后精子的动态、形态变化。方法对78例精液标本分别行上游法和密度梯度离心法优选,处理前后均用伟力精子分析系统和Diff-Quick快速染色法进行精子动态、形态分析。结果经两种方法优化后精子密度、活率、活力都有显著提高(P<0.05),同时精子畸形率有显著降低(P<0.05)。结论两种精子优化法均可以提高精子质量,有助于IUI(宫腔内人工授精)助孕患者达到受孕目的 。

氯化铯密度梯度离心法提纯枣疯病植原体DNA

本研究利用CTAB法提取感染枣疯病的枣树叶片总DNA,再通过氯化铯-双苯酰亚胺密度梯度离心从总DNA中富集纯化枣疯病植原体DNA。利用枣树26S r DNA基因和枣疯病植原体16S r DNA基因的特异引物,分别对富集纯化前后感病枣树叶片总DNA进行PCR扩增。结果表明,模板浓度为1 ng/μL时,富集后的总DNA模板扩增枣树26S r DNA的电泳条带亮度低于富集前,扩增枣疯病植原体16S r DNA电泳条带亮度明显高于富集前。Real-time PCR检测结果表明,模板浓度为1 ng/μL时,纯化后的枣疯病植原体DNA中26S r DNA相对纯化前的量为0.0638,而JWB相对纯化前的量为0.5035,这说明采用氯化铯-双苯酰亚胺密度梯度离心法可以有效地从感染枣疯病枣树总DNA中富集纯化枣疯病植原体DNA。

煤显微组分分离富集

单组分成烃热模拟实验已成为煤成烃研究的重要组成部分，煤显微组分分离是上述研究的重要前提。实验结果证明：单纯应用某一种方法效果往往不佳，而采用人工碎样→筛选法→浮选法（沉淀法）→高速离心法这一综合的显微组分分离方法，则可以获得高纯度的显微组分。

密度梯度离心法结合上游法优化精液对体外受精-胚胎移植临床结局的影响

目的评价密度梯度离心(DGC)法、上游法及DGC结合上游法处理精液对体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的临床效果。方法以解放军第101医院生殖医学中心2013年12月至2016年3月206个IVF-ET治疗周期的患者为研究对象,其中104个周期采用DGC法处理精液,30个周期采用上游法处理精子,72个周期采用DGC法结合上游法处理精子,比较3种精液优化处理方法的受精率、优质胚胎率、胚胎种植率、临床妊娠率。结果 DGC结合上游法的受精率显著高于单独DGC法,差异有统计学意义(P<0.05),高于上游法,但差异无统计学意义(P>0.05);3种精液处理方法的优质胚胎率、胚胎种植率和临床妊娠率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论与单独DGC法或上游法比较,DGC结合上游法有助于提高受精率,值得在IVF-ET治疗中应用。

HER2高表达的人乳腺癌原代细胞模型的建立

目的:探讨人乳腺癌恶性胸水肿瘤细胞的分离、纯化、培养与肿瘤细胞的鉴定,为HER2阳性的人乳腺癌的研究提供肿瘤原代细胞模型。方法:利用淋巴细胞分离液及密度梯度离心法分离、纯化恶性胸水肿瘤细胞,分离得到的细胞培养并传至第5代,通过流式细胞仪分选肿瘤细胞、Q-PCR技术、Western blot技术验证细胞HER2分子的表达水平、通过裸鼠荷瘤实验检测细胞的成瘤能力。结果:淋巴细胞分离液及密度梯度离心法分离得到乳腺癌原代细胞;流式细胞分选结果显示未分选出HER2高表达的肿瘤细胞;Q-PCR及Western blot检测发现分离得到的细胞在mRNA及蛋白水平HER2的表达水平高于乳腺癌MCF-7细胞;裸鼠荷瘤实验结果显示分离得到的细胞可以成功荷瘤。结论:胸水中分离得到的细胞为HER2阳性的乳腺癌原代细胞;对于原代细胞的鉴定需要采用不同的方法加以论证。