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FasL和Der p2双基因共表达真核表达载体的构建及其在树突状细胞中的表达 被引量:3
1
作者 王彦 吴奎 +1 位作者 毕玉田 王长征 《重庆医学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第20期2697-2699,2703,共4页
目的构建小鼠FasL基因和屋尘螨主要抗原Der p2双基因共表达载体,并检测其在树突状细胞(DC)中的表达。方法以plambd-Der p2为模板扩增Der p2基因,双酶切pIRES2EGFP和Der p2基因,将Der p2基因克隆入pIRES2EGFP得pIRES2EGFP-Der p2。双酶切... 目的构建小鼠FasL基因和屋尘螨主要抗原Der p2双基因共表达载体,并检测其在树突状细胞(DC)中的表达。方法以plambd-Der p2为模板扩增Der p2基因,双酶切pIRES2EGFP和Der p2基因,将Der p2基因克隆入pIRES2EGFP得pIRES2EGFP-Der p2。双酶切pMD18T-FasL质粒获得FasL片段,克隆入pIRES2EGFP-Der p2,获得FasL和Der p2共表达重组载体pIRES2EGFP-FasL-Der p2,采用酶切及测序鉴定重组质粒。将重组质粒转染DC,采用RT-PCR和Western Blot法检测FasL和Der p2基因的mRNA及蛋白水平的表达。结果测序证实FasL和Der p2基因序列完全正确。重组质粒转染DC后,能表达FasL和Der p2的mRNA和蛋白。结论成功构建FasL和Der p2双基因共表达重组载体pIRES2EGFP-FasL-Der p2,转染DC后能在体外正确表达FasL和Der p2基因。 展开更多
关键词 FASL derp2 共表达 树突状细胞
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口咽胃肠道环境对Der p2-rBCG行为的影响 被引量:2
2
作者 史皆然 师长宏 +1 位作者 吴昌归 张金山 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2005年第5期600-603,共4页
目的:观察口服接种过敏原基因(Der p2)重组(r)BCG口咽胃肠道环境对Der p2-rBCG行为的影响. 方法:以野生BCG为对照,给予Balb/c小鼠口服接种三种方式(分泌、胞壁和胞内)表达Der p2的rBCG1×109CFU,连续5 d,计数不同时间粪便、口咽淋... 目的:观察口服接种过敏原基因(Der p2)重组(r)BCG口咽胃肠道环境对Der p2-rBCG行为的影响. 方法:以野生BCG为对照,给予Balb/c小鼠口服接种三种方式(分泌、胞壁和胞内)表达Der p2的rBCG1×109CFU,连续5 d,计数不同时间粪便、口咽淋巴组织(OLT)、消化道相关淋巴组织(GALT)以及肝脏、脾脏和肺脏中BCG的细菌数;用PCR和内参照RT—PCR法测定由rBCG携带入各组织中的Der p2存在和表达状况. 结果:三种rBCG均可通过口咽和胃肠道黏膜,进入黏膜相关淋巴组织;各淋巴组织中的rBCG仍能表达其所携带的外源基因,并在各淋巴组织中表达外源蛋白. 结论:rBCG口服免疫后口咽胃肠道环境对rBCG生物学行为所产生的影响并不妨碍诱导理想的免疫应答. 展开更多
关键词 der 口咽 环境 Balb/c小鼠 黏膜相关淋巴组织 rBCG 口服接种 胃肠道黏膜 生物学行为 不同时间 PCR法 表达状况 外源基因 免疫应答 外源蛋白 原基因 消化道 细菌数 免疫后
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Der p2基因真核表达载体的构建及其在小鼠树突状细胞中表达 被引量:1
3
作者 毕玉田 王彦 +2 位作者 吴奎 王长征 钱桂生 《重庆医学》 CAS CSCD 2006年第11期997-999,共3页
目的构建Der p2真核表达载体,并证明能在小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)中表达。方法采用分子生物学方法,将原核表达质粒plambd Der p2携带的Der p2全长cDNA切下,重组到真核表达质粒pCI-neo中,然后在脂质体介导下,将重组质粒转染到小鼠... 目的构建Der p2真核表达载体,并证明能在小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)中表达。方法采用分子生物学方法,将原核表达质粒plambd Der p2携带的Der p2全长cDNA切下,重组到真核表达质粒pCI-neo中,然后在脂质体介导下,将重组质粒转染到小鼠骨髓来源的DC,并用RT-PCR、Western Blot检测Der p2 mRNA和蛋白表达。结果测序证实构建的重组质粒中携带了Der p2的全长cDNA序列,且与Gene Bank序列完全一致;重组质粒转染小鼠DC后,能产生Der p2 mRNA和蛋白。结论成功构建重组Der p2基因真核表达载体,其转染DC后,能有效地表达于DC中。 展开更多
关键词 der p2 载体构建 树突状细胞
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胞壁形式表达融合蛋白Der p2-PEB1重组BCG的构建和鉴定 被引量:3
4
作者 邵成 史皆然 +2 位作者 郭晓雅 胡琳洁 侯美娜 《科学技术与工程》 2010年第17期4135-4138,4144,共5页
利用重组BCG技术,构建能以胞壁形式表达屋尘螨Der p2和PEB1抗原的重组BCG口服哮喘疫苗pCW-Der p2-PEB1-rBCG,以pCW-Der p2质粒和pUC-PEB1质粒DNA为模板扩增基因,构建出重组质粒pCW-Der p2-PEB1。将重组质粒电穿导入BCG感受态细胞,潮霉... 利用重组BCG技术,构建能以胞壁形式表达屋尘螨Der p2和PEB1抗原的重组BCG口服哮喘疫苗pCW-Der p2-PEB1-rBCG,以pCW-Der p2质粒和pUC-PEB1质粒DNA为模板扩增基因,构建出重组质粒pCW-Der p2-PEB1。将重组质粒电穿导入BCG感受态细胞,潮霉素抗性筛选rBCG阳性克隆。阳性rBCG经PCR特异性扩增目的基因片段Der p2及PEB1,证实其中含有目的基因。用抗Der p2单克隆抗体和制备的小鼠PEB1抗血清对rBCG进行间接免疫荧光鉴定。结果成功扩增了Derp2及PEB1基因,构建出重组质粒pCW-Der p2-PEB1,并将质粒电穿入BCG中,免疫荧光法鉴定其成功。说明成功地构建了胞壁表达Derp2-PEB1融合蛋白重组BCGpCW-Der p2-PEB1-rBCG。为基因工程疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 PEB1 屋尘螨抗原der p2 重组BCG
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屋尘螨变应原Der p2 T细胞表位疫苗对哮喘小鼠的特异性免疫治疗效果 被引量:3
5
作者 湛孝东 段彬彬 +1 位作者 洪勇 李朝品 《中国血吸虫病防治杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期59-63,共5页
目的探讨屋尘螨变应原Der p2的4个T细胞表位融合肽对哮喘小鼠的特异性免疫治疗效果。方法 30只雌性BALB/c小鼠随机分为3组,分别为阴性对照组(PBS组)、阳性对照组(哮喘组)以及Der p2 T细胞融合肽治疗组(Der p2 T组)。用屋尘螨粗提取液致... 目的探讨屋尘螨变应原Der p2的4个T细胞表位融合肽对哮喘小鼠的特异性免疫治疗效果。方法 30只雌性BALB/c小鼠随机分为3组,分别为阴性对照组(PBS组)、阳性对照组(哮喘组)以及Der p2 T细胞融合肽治疗组(Der p2 T组)。用屋尘螨粗提取液致敏小鼠建立哮喘模型,PBS组以PBS缓冲液代替,Der p2 T组分别于小鼠致敏第25~27天雾化致敏前30 min行背部皮下注射相应治疗蛋白。最后一次雾化激发24 h后,收集各组小鼠血清及支气管肺泡灌洗液(BALF)。采用ELISA法检测小鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-13以及血清中屋尘螨粗提取液致敏的特异性IgE、IgG2a抗体水平,并行肺组织切片HE染色。结果哮喘组小鼠BALF中的嗜酸性粒细胞数量为(5.57±0.64)×10~5个/ml,高于PBS组[(0.50±0.30)×10~5个/ml](P<0.01)和Der p2 T组[(3.45±0.36)×10~5个/ml](P<0.01)。PBS组、哮喘组、Der p2 T组小鼠BALF中IFN-γ含量分别为(267.00±21.98)、(155.80±20.53)pg/ml和(234.40±24.46)pg/ml;与哮喘组比较,Der p2 T组小鼠BALF中产生了较高的IFN-γ水平(P<0.01)。PBS组、哮喘组、Der p2 T组小鼠BALF中IL-4含量分别为(23.40±5.96)、(53.28±8.26)pg/ml和(30.00±5.50)pg/ml;与哮喘组比较,Der p2 T组小鼠BALF中IL-4含量显著降低(P<0.01)。与哮喘组[(308.10±28.32)pg/ml]比较,Der p2 T组小鼠BALF中IL-13含量[(174.50±25.99)pg/ml]显著下降(P<0.01);PBS组鼠BALF中IL-13含量为(95.99±31.14)pg/ml。肺组织切片显示,Der p2 T组小鼠肺部炎症较哮喘组明显减轻,且炎性细胞浸润显著减少、气道上皮结构重塑。结论 Der p2 T细胞表位融合肽可有效改善哮喘小鼠变态反应性气道及肺部炎症,可作为屋尘螨哮喘患者特异性免疫治疗的候选疫苗。 展开更多
关键词 屋尘螨 der p2 T细胞表位 哮喘 免疫治疗
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过敏性哮喘小鼠树突状细胞负荷Der p2后改变及与T细胞增殖分化的关系研究 被引量:1
6
作者 连利霞 彭霞 +3 位作者 李莉 朱伟彦 安云霞 孔存权 《现代生物医学进展》 CAS 2014年第35期6843-6847,共5页
目的:探讨哮喘小鼠与正常小鼠骨髓源性树突状细胞(DC)负荷Der p2抗原后表达表面分子(CD11c、CD86)和细胞因子(IL-10、IL-12p70)的差异及其对Th1和Th2型细胞因子平衡的影响,进一步研究过敏性哮喘发生中DC的可能作用。方法:分别从哮喘组... 目的:探讨哮喘小鼠与正常小鼠骨髓源性树突状细胞(DC)负荷Der p2抗原后表达表面分子(CD11c、CD86)和细胞因子(IL-10、IL-12p70)的差异及其对Th1和Th2型细胞因子平衡的影响,进一步研究过敏性哮喘发生中DC的可能作用。方法:分别从哮喘组和对照组提取骨髓培养DC,第五天负荷Der p2,24小时后吹打收集细胞,观察DC形态,用流式细胞仪检测孵育后细胞表面CD11c、CD86表达。并留取负荷Der f2前后培养上清,ELISA法检测IL-10及IL-12p70含量。同时以DC:反应细胞比例为1:10混合培养,72 h后ELISA法检测混合培养上清中IL-4、IL-5、IFN-γ的水平。结果:1负荷Der p2后,哮喘组CD86、CD11c表达比对照组高,分别为(t=11,P<0.05)(t=4.9,P<0.05),差异有统计学意义;2在细胞因子分泌方面,Der p2负荷前,两组DC均能分泌IL-10与IL-12p70,IL-10水平哮喘组高(t=9.5,P<0.05),而IL-12p70水平对照组高(P<0.05);负荷Der p2后,对照组IL-10、IL-12p7分泌量比负荷前明显增加(P<0.05),哮喘组无明显差异(P>0.05);3在DC刺激同种T细胞因子分泌方面,负荷Der p2后哮喘组DC刺激T细胞分泌IL-4、IL-5分泌能力明显增强(P<0.05),而刺激INF-γ能力降低(P<0.05)。结论:DC在过敏性哮喘中起着重要作用,异常DC通过增加CD86、CD11c的表达和减少IL-10及IL-12的合成,致使T细胞向Th2细胞优势分化。 展开更多
关键词 过敏性哮喘 树突状细胞 der p2
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屋尘螨致敏蛋白组分Derp1、Derp2和Derp10检测的临床意义 被引量:7
7
作者 郑佩燕 孙宝清 《中华临床免疫和变态反应杂志》 2014年第2期150-154,共5页
尘螨是最常见的室内变应原来源之一,诱导人IgE反应最主要的尘螨是屋尘螨和粉尘螨。为了解变应原IgE组分检测的临床诊断意义和作用,该文就Der p1、Der p2和Der p10的研究进展进行综述。
关键词 屋尘螨 der-p1 der-p2 der-p10 原肌球蛋白
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Construction of a Der p2-transgenic plant for the alleviation of airway inflammation
8
作者 CC Lee H Ho +2 位作者 KT Lee ST Jeng BL Chiang 《Cellular & Molecular Immunology》 SCIE CAS CSCD 2011年第5期404-414,共11页
In clinical therapy,the amount of antigen administered to achieve oral tolerance for allergic diseases is large,and the cost is a major consideration.In this study,we used tobacco plants to develop a large-scale prote... In clinical therapy,the amount of antigen administered to achieve oral tolerance for allergic diseases is large,and the cost is a major consideration.In this study,we used tobacco plants to develop a large-scale protein production system for allergen-specific immunotherapy,and we investigated the mechanisms of oral tolerance induced by a transgenic plant-derived antigen.We used plants(tobacco leaves)transgenic for the Dermatophagoides pteronyssinus 2(Der p2)antigen to produce Der p2.Mice received total protein extract from Der p2 orally once per day over 6 days(days 0–2 and days 6–8).Mice were also sensitized and challenged with yeast-derived recombinant Der p2(rDer p2),after which the mice were examined for airway hyper-responsiveness and airway inflammation.After sensitization and challenge with rDer p2,mice that were fed with total protein extracted from transgenic plants showed decreases in serum Der p2-specific IgE and IgG1 titers,decreased IL-5 and eotaxin levels in bronchial alveolar lavage fluid,and eosinophil infiltration in the airway.In addition,hyper-responsiveness was also decreased in mice that were fed with total protein extracted from transgenic plants,and CD4^(+)CD25^(+)Foxp3^(+) regulatory T cells were significantly increased in mediastinal and mesenteric lymph nodes.Furthermore,splenocytes isolated from transgenic plant protein-fed mice exhibited decreased proliferation and increased IL-10 secretion after stimulation with rDer p2.The data here suggest that allergen-expressing transgenic plants could be used for therapeutic purposes for allergic diseases. 展开更多
关键词 ASTHMA der p2 IL-10 oral tolerance transgenic plant
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沙门菌Omp D介导的rBCG口服疫苗的制备与鉴定
9
作者 郭晓雅 邵成 +2 位作者 胡琳洁 侯美娜 史皆然 《国际呼吸杂志》 2012年第19期1457-1462,F0003,共7页
目的利用重组BCG(rBCG)技术,构建能以串联和并联形式、在细菌表面表达Derp2和OmpD抗原的两种rBCGLI服疫苗。方法经PCR法分别扩增获得Derp2和OmpD基因,测序正确后将两者克隆人原核表达载体pProEXHTb,获得pProEXHTb-De.rp2-OmpD质... 目的利用重组BCG(rBCG)技术,构建能以串联和并联形式、在细菌表面表达Derp2和OmpD抗原的两种rBCGLI服疫苗。方法经PCR法分别扩增获得Derp2和OmpD基因,测序正确后将两者克隆人原核表达载体pProEXHTb,获得pProEXHTb-De.rp2-OmpD质粒。①串联表达:将Derp2-OmpD融合基因亚克隆人穿梭胞壁表达载体pCW,经酶切鉴定阳性命名为pCW-Derp2-OmpD质粒。将此重组质粒电穿导人BCG感受态细胞,构建可胞壁串噘表达Derp2-OmpD融合蛋白的rBCG;②并联表达:构建pCW-Derp2与pCW-OmpD两种质粒,井将二者同时电穿导人BCG感受态细胞,以构建胞壁并联表达Derp2和OmpD蛋白的rBCG。经潮霉素抗性筛选的阳性克隆,均采用以下三种方式进行鉴定:PCR特异性扩增目的基因片段;用兔抗Derp2多克隆抗体与兔抗OmpD多克隆抗体对阳性克隆分别进行斑点免疫杂交法和间接免疫荧光法鉴定。结果采用基因工程手段制备出以胞壁形式串联和并联表达Derp2和OmpD蛋白的两种rBCG口服疫苗,并通过PCR、斑点免疫杂交法及间接免疫荧光法分别进行鉴定。结论两种rBCG口服疫苗构建成功,为体外实验和临床应用提供基础。 展开更多
关键词 OMP D 屋尘螨抗原der p2 重组BCG 口服疫苗
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比较口服不同亲和力重组耻垢分支杆菌调节免疫的差异 被引量:1
10
作者 解婷 薛莹 +1 位作者 樊爱琳 简文 《现代生物医学进展》 CAS 2013年第8期1435-1438,1477,共5页
目的:Th1与Th2的平衡紊乱是过敏性哮喘的免疫学基础,本研究通过给予小鼠口服免疫不同亲和力屋尘螨抗原Der p2重组耻垢分枝杆菌,来比较其调节免疫应答的差异。方法:1,分别给予6-8周BALB/c小鼠口服接种Mycobacterium Smegmatis(M.S)、pCW-... 目的:Th1与Th2的平衡紊乱是过敏性哮喘的免疫学基础,本研究通过给予小鼠口服免疫不同亲和力屋尘螨抗原Der p2重组耻垢分枝杆菌,来比较其调节免疫应答的差异。方法:1,分别给予6-8周BALB/c小鼠口服接种Mycobacterium Smegmatis(M.S)、pCW-Der p2-rM.S及pCW-Der p2-PEB1-rM.S,在末次免疫后第14、28、56天分别用夹心ELISA法测定小鼠血清及脾脏淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-2及IL-4的含量。结果:夹心ELISA结果显示,无论是血清还是脾脏淋巴细胞培养上清中,各组IFN-γ、IL-2水平逐渐升高,IL-4水平逐渐降低,8周时更明显,pCW-Der p2-PEB1-rM.S组与M.S、pCW-Der p2-rM.S组相比有明显统计学差异。体外给予Der p2蛋白刺激后,pCW-Der p2-rM.S及pCW-Der p2-PEB1-rM.S组变化更加明显,而M.S组无明显变化。结论:小鼠口服免疫pCW-Der p2-PEB1-rM.S能明显提高Th1型免疫反应,与pCW-Der p2-rM.S组相比有统计学学差异。三种不同亲和力重组耻垢分枝杆菌经口服后均能诱导小鼠产生Th1型免疫应答,且pCW-Der p2-rM.S及pCW-Der p2-PEB1-rM.S诱导产生的Th1优势应答具有Der p2抗原特异性。本研究弥补了粘膜型疫苗低亲和力的不足,为新型口服疫苗的制备和改进创造了条件。 展开更多
关键词 derp2 PEB1 耻垢分枝杆菌 口服疫苗 TH1 TH2
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重组屋尘螨变应原突变体的免疫原性与过敏原性研究
11
作者 杨小琼 戴曦 +1 位作者 李国平 王孝芸 《国际免疫学杂志》 CAS 2016年第1期8-13,共6页
目的 构建屋尘螨Der p2变应原突变体的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达、纯化,以观察屋尘螨Der p2变应原突变体的免疫原性以及抗原性.方法 基因敲除屋尘螨Der p2变应原的部分氨基酸残基序列,将编码基因定向克隆到pET32a原核表达质粒中... 目的 构建屋尘螨Der p2变应原突变体的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达、纯化,以观察屋尘螨Der p2变应原突变体的免疫原性以及抗原性.方法 基因敲除屋尘螨Der p2变应原的部分氨基酸残基序列,将编码基因定向克隆到pET32a原核表达质粒中,转入BL21表达菌中并提纯;将18只Balb/c小鼠随机分为Der p2变应原突变体组、重组Der p2组和对照组.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组小鼠血清中IgE、IgG1与IgG2a抗体变化,用免疫斑点试验测定Der p2突变体的IgE结合能力.结果 成功构建了Der p2变应原突变体的原核表达质粒,表达并纯化了Der p2变应原突变体.腹腔免疫后0d,各组IgE、IgG1与IgG2a抗体表达无明显变化(P=0.067、P=0.052、P=0.078);免疫后第7d,重组Der p2变应原组诱导IgE抗体的产生量高于Der p2变应原突变体组(P =0.002),重组Der p2变应原组诱导的IgG2a抗体高于Der p2变应原突变体组(P=0.0056);腹腔免疫后第14 d,重组Der p2变应原组IgE抗体的产生量高于Der p2变应原突变体组(P=0.001),Der p2变应原突变体组IgG2a低于重组Der p2变应原组(P=0.0034).Der p2变应原突变体与屋尘螨过敏患者的阳性血清结合明显较低.结论 Der p2变应原突变体能诱导小鼠产生IgG1抗体和IgG2a抗体,同时能明显减少IgE抗体的产生,并且Der p2变应原突变体具有较低的IgE结合能力. 展开更多
关键词 屋尘螨 der p2变应原 免疫原性 过敏原性
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