保肾通络方含药血清对高糖培养足细胞Nephrin、 Desmin蛋白表达及细胞凋亡的影响

目的:探讨保肾通络方含药血清对于高糖培养下足细胞肾病蛋白(Nephrin)、结蛋白(Desmin)表达及细胞凋亡的影响。方法:细胞实验分为正常对照组、模型组和保肾通络方低、中、高剂量组。正常对照组足细胞予DMEM低糖培养基培养,模型组和保肾通络方不同剂量组予含有30 mmol/L葡萄糖的高糖培养基培养。保肾通络方不同剂量组足细胞在高糖培养基中分别加入保肾通络方含药血清低、中、高剂量进行干预,正常对照组及模型组加入等剂量空白血清。CCK-8法检测足细胞的细胞活性,免疫荧光及RT-PCR检测足细胞Nephrin、Desmin蛋白及mRNA表达水平,免疫荧光检测足细胞凋亡相关蛋白Caspase-3蛋白表达,Hochest33258染色检测足细胞凋亡情况。结果:与正常对照组比较,模型组足细胞的细胞活性明显降低,Nephrin蛋白表达明显下调,Desmin、Caspase-3蛋白表达明显上调,足细胞凋亡细胞数目明显增加(均P<0.05)。与模型组比较,保肾通络方低、中、高剂量组足细胞的细胞活性明显升高,Nephrin蛋白表达明显上调,Desmin、Caspase-3蛋白表达明显下调,足细胞凋亡数目明显减少(均P<0.05)。结论:保肾通络方可能通过上调足细胞Nephrin蛋白表达,下调Desmin蛋白表达,抑制足细胞凋亡,进而减轻足细胞损伤。

鼠源Desmin基因克隆表达及其生物信息学分析

【目的】构建鼠源III型中间丝蛋白Desmin真核/原核表达载体,明确鼠源Desmin蛋白生物学功能,为在体外及细胞内表达系统中鉴定Desmin互作蛋白及探索其作用网络提供理论依据。【方法】通过RT-PCR克隆Desmin基因,分别构建原核表达载体pGEX-4T-1-Desmin-Flag和真核表达载体pcDNA3.0-Desmin-Flag,以IPTG对原核表达载体进行诱导表达,并通过ProtParam、ProtScale、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件对Desmin蛋白进行生物信息学分析。【结果】鼠源Desmin基因长1410 bp,选用pGEX-4T-1载体和pcDNA3.0载体分别成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-Desmin-Flag和真核表达载体pcDNA3.0-Desmin-Flag。原核表达载体pGEX-4T-1-Desmin-Flag转化大肠杆菌后经IPTG诱导,成功表达出70 kD的融合蛋白Desmin-Flag;真核表达载体pcDNA3.0-Desmin-Flag转染BHK-21细胞,通过Western blotting在56 kD处检测到Flag标签,即Desmin蛋白能在真核细胞成功表达,且主要定位在细胞质。Desmin蛋白由470个氨基酸残基组成,分子量为54 kD,分子式为C2299H3722N688O755S13,理论等电点(pI)为5.21,属于不稳定蛋白;蛋白脂溶系数为79.94,平均亲水系数(GRAVY)为-0.721,推测为亲水性蛋白;无跨膜结构域和信号肽;其二级结构由α-螺旋(占67.59%)、无规则卷曲(占22.39%)、β-转角(占1.92%)和延伸链(占8.10%)构成。【结论】鼠源Desmin蛋白在原核表达体系中主要以包涵体形式进行表达,在真核细胞中表达主要定位于细胞质,呈骨架结构分布,其理化性质不稳定,属亲水性蛋白,无跨膜结构域和信号肽。Desmin作为一种重要的III型中间丝蛋白,在神经肌肉组织信号转导及与相关蛋白发生相互作用方面发挥重要作用。

针刺对脑梗死大鼠骨骼肌vimentin、desmin基因表达的影响

目的观察针刺对脑梗死大鼠骨骼肌vimentin、desmin基因表达的影响,初步探讨针刺对脑梗死偏瘫大鼠骨骼肌的作用机制。方法将100只SD大鼠按随机数字表法分为:A组(头部穴位组)、B组(躯体穴位组)、C组(头部+躯体穴位组)、D组(模型组)、E组(空白组),每组20只,组内再按随机数字表法分为0、24、48 h组,每组5只。采用大脑中动脉线栓法制备大鼠脑缺血模型,将成功建立的大鼠模型,随机二次分组,每组20只,正常喂养。A组:针刺大鼠的头部穴位:百会、风府;B组:针刺大鼠躯体穴位后会、环跳、前三里、阳陵泉、后三里。C组:针刺大鼠的百会、风府、后会、环跳、前三里、阳陵泉、后三里。以上三组均针刺一次,捻转1min,平补平泻,留针30min;D组:造模后不施加任何刺激;E组:空白对照不造模,正常喂养,以上2组不予针刺。按时相在规定的骨骼肌部位(前肢肌、腓肠肌)取材并标记,采用qRT-PCR检测,得出不同时相针刺后的vimentin、desminm的mRNA表达变化情况。结果在实验中,所取骨骼肌部位vimentin及desmin的mRNA表达均出现显著差异(P<0.05),其中,在前肢肌vmentin的mRNA表达中,C组在0、24 h时表达量呈较明显上调趋势。在前肢肌及腓肠肌vimentin、前肢肌及腓肠肌desmin的mRNA表达中,B组表达量在0、24 h时均呈现明显上调。A组在前肢肌vimentin、前肢肌desmin、腓肠肌desmin的mRNA表达量中,在0、24、48 h均呈现上调。D组较A组、B组、C组的前肢肌vimentin、腓肠肌vimentin、前肢肌desmin、腓肠肌desmin的mRNA表达量在48 h时呈现明显上调。结论实验结果提示针刺改善脑梗死偏瘫骨骼肌肌力的机制可能是通过针刺对外周效应器的局部刺激,在改善局部功能的同时,引起中枢脑组织的修复,从而增强了外周效应器的康复,证实外周-中枢-外周的部分作用机制。

“调理脾胃针刺法”对2型糖尿病肾病大鼠足细胞中PCX、CD2AP、nephrin、desmin表达的影响

目的 研究“调理脾胃针刺法”对2型糖尿病肾病大鼠足细胞中足细胞标记蛋白(PCX)、CD2相关蛋白(CD2AP)、肾病蛋白(nephrin)、结蛋白(desmin)基因表达的影响,并阐明其可能的作用机制。方法 将70只健康雄性SD大鼠,随机分为模型组52只,空白组18只,将模型组大鼠喂养8周高脂高糖饲料之后,腹腔低剂量(30 mg·kg-1)注射链脲佐菌素,建立2型糖尿病肾病大鼠模型。将造模成功的36只大鼠按照血糖值,以及尿蛋白定性结果构成比,采用分层随机的方法分为针刺组4周(n=6),模型组4周(n=6);针刺组8周(n=6),模型组8周(n=6);针刺组12周(n=6),模型组12周(n=6)。空白组随机分为空白组4周(n=6)、空白组8周(n=6)、空白组12周(n=6)。将针刺组穿着针刺罩衣固定,采用“调理脾胃针刺法”干预,分别针刺4周、8周及12周。模型组和空白组予相同抓取固定。观测各组干预不同周期后,测定24h尿蛋白;采用HE染色光镜下观察大鼠肾脏病理变化情况;采用荧光定量PCR法检测PCX、CD2AP、nephrin和desmin mRNA表达水平。结果 4周、8周及12周后各组组间比较,针刺组24h尿蛋白含量低于模型组(P <0.05);肾脏HE染色,模型组肾小球增生,散在炎性细胞浸润,部分肾小管管腔变窄,系膜基质增生,基底膜轻度增厚,而针刺组上述病理变化均小于模型组(P <0.05);4周、8周及12周后各组组间比较,针刺组PCX、CD2AP和nephrin mRNA表达显著高于模型组(P <0.01);8周、12周后各组组间比较,针刺组desmin基因表达显著低于模型组(P <0.01)。结论 “调理脾胃针刺法”可降低2型糖尿病肾病大鼠24 h尿蛋白含量,通过其肾脏足细胞PCX、CD2AP、nephrin蛋白及基因表达的水平,降低desmin蛋白及基因表达的水平,以改善2型糖尿病肾病大鼠足细胞损伤,减轻肾小球基底膜增厚,从而延缓DN的进展,其降低尿蛋白含量的作用机制可能与此相关。

大黄虫丸对阿霉素肾病大鼠足细胞骨架蛋白desmin影响的实验研究

目的:探讨大黄虫丸对阿霉素肾病大鼠足细胞损伤的保护作用。方法:SD大鼠一次性尾静脉注射阿霉素5 mg/kg,随机分为模型组和大黄虫丸组,另以8只正常大鼠作为对照组,进行对比观察。于实验第7日、14日,各处死4只模型组大鼠,留取肾脏标本待测。实验第28日,大鼠测尿蛋白后,全部处死,观察大鼠肾组织病理形态学变化及超微结构的改变,应用免疫荧光方法定位及半定量分析研究足细胞损伤标志蛋白-desmin的表达变化。结果:与正常对照组比较,阿霉素肾病大鼠肾小球内desmin蛋白表达上调,足细胞部分足突融合,尿白蛋白排泄率增高。结论:大黄虫丸可明显减轻阿霉素肾病大鼠肾小球内desmin蛋白的表达,减轻足细胞足突融合,降低尿白蛋白排泄率。大黄虫丸对阿霉素肾病大鼠的足细胞损害有一定的保护作用。

克山病患者心肌组织细胞凋亡及结构蛋白Desmin异常表达的研究

目的探讨细胞凋亡及结构蛋白Ｄｅｓｍｉｎ异常表达与亚急型、慢型克山病的关系。方法应用原位末端标记法（ＴＵＮＥＬ）及免疫组化技术在亚急型和慢型克山病患者心肌石蜡包埋组织切片上进行细胞凋亡及Ｄｅｓｍｉｎ双重荧光染色，并应用共聚焦显微镜观察结果。结果克山病患者心肌组织中可见结构蛋白Ｄｅｓｍｉｎ的异常荧光染色及细胞凋亡，有Ｄｅｓｍｉｎ荧光染色变浅甚至消失，慢型克山病多表现为染色增强，或呈团状聚集于心肌细胞中间，或呈块状附于细胞膜下。凋亡细胞多见于有Ｄｅｓｍｉｎ异常改变的心肌细胞、浸润的炎细胞、血管内皮细胞及一些间质细胞。结论细胞凋亡与结构蛋白Ｄｅｓｍｉｎ异常参与克山病的发生与发展。

足细胞损伤标志Desmin蛋白在甲状腺功能减退症模型大鼠肾脏中的表达及与甲状腺功能的关系

目的观察甲状腺功能减退症(甲减)大鼠肾脏损伤时足细胞损伤标志Desmin蛋白在肾组织中的表达,探讨甲减肾脏损伤的发生机制以及与甲状腺功能的关系。方法用丙基硫氧嘧啶(PTU)连续灌胃制作甲减大鼠模型。分别动态观察对照组、甲减组和干预组〔给予左甲状腺素钠(L-T4)和停止给予PTU进行干预治疗〕大鼠的肾脏病理改变及损伤情况,并同时应用免疫组化技术检测Desmin在肾组织中的表达情况。结果 甲减大鼠出现肾脏损伤,并且随着病程进展逐渐加重,并与甲状腺功能密切相关。干预组肾组织损伤均较甲减组减轻。结论甲减时肾脏损伤与足细胞相关,甲状腺激素参与足细胞损伤。

补充大豆蛋白对大鼠离心运动后骨骼肌细胞骨架Desmin和Vimentin的影响

目的:观察补充蛋白质对骨骼肌细胞骨架desmin和vimentin免疫染色的影响,研究蛋白质对运动性骨骼肌微结构损伤的保护作用。方法:雄性SD大鼠100只按补充安慰剂、大豆分离蛋白,运动与不运动,以及运动后即刻、12 h、24 h和48 h等不同时间随机分为10组,所有动物膳食平衡1 w后进行实验。运动组大鼠以(20±1)m/min的速度,坡度为-16°,持续性跑台训练120 min。实验组和对照组所有动物在膳食平衡期间每天分别灌胃15%大豆分离蛋白2 ml和等量的纯净水。结果:补充大豆分离蛋白可减轻大鼠离心运动后骨骼肌细胞骨架desmin免疫染色的丢失,增强vimentin免疫染色。

Desmin蛋白与局灶节段性肾小球硬化的相关性研究

目的探讨局灶节段性肾小球硬化(FSGS)大鼠Desmin蛋白与足细胞损伤在FSGS发生发展中的作用。方法测定阿霉素诱导的FSGS大鼠24h尿蛋白定量(24h UP)、血生化指标,计算内生肌酐清除率(Ccr);观察组织学变化并计算肾小球硬化指数(SI)、肾小球细胞外基质面积与肾小球面积之比(ECM/GA);免疫组织化学方法检测肾小球Desmin蛋白的表达,用图像分析软件测定肾小球Desmin蛋白表达的平均光密度值,并将FSGS大鼠肾小球Desmin蛋白的表达与以上指标进行相关性分析。结果FSGS组大鼠的24h UP、胆固醇、SI及ECM/GA明显高于正常对照组(P<0.001),白蛋白、Ccr较正常对照组明显降低(P<0.001);FSGS组大鼠Desmin蛋白的表达上调。Desmin蛋白的表达变化与24h UP、SI及ECM/GA呈正相关(r=0.899～0.930,P均<0.05),与Ccr呈负相关(r=-0.927,P<0.01),与白蛋白、胆固醇无相关性(r=0.371、0.710,P均>0.05)。结论大量蛋白尿及内生肌酐清除率下降可以作为肾小球足细胞损伤的重要特征,足细胞数量是决定FSGS的主要因素之一。

扩张型心肌病与Desmin及血小板活化因子乙酰水解酶基因相关性研究

目的探讨中国扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy,DCM)人群中是否存在Desmin基因外显子8上的一个错意突变(Ile451Met)及检测血小板活化因子乙酰水解酶(platelet-activatingfactoracetylhydrolase,PAF-AH)基因G994→T错义突变发生频率,以及它们与DCM的关系。方法通过聚合酶链反应、限制性内切酶酶切、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染技术,结合DNA测序分析89例DCM患者和110例对照组Desmin基因及PAF-AH基因可能突变位点(Ile451Met,Val279Phe)。结果通过上述方法检测后未能发现两组中存在Desmin基因(Ile451Met)突变,PAF-AH基因突变(Val279Phe)发生频率在病例组及对照组间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论在小样本中国成都地区扩张型心肌病患者中,未发现Desmin基因第8外显子存在Ile451Met突变,并且与PAF-AH基因突变(Val279Phe)无明显相关。

黄芪多糖对高糖刺激小鼠肾小球足细胞Nephrin和Desmin表达的影响

目的模拟体外高糖病理微环境,探讨黄芪多糖对实验鼠肾脏肾小球足细胞Nephrin及Desmin表达的影响.方法试验(1):将培养的实验鼠肾脏肾小球足细胞分为5个组,分别是D-葡萄糖30 mmol/L+黄芪多糖干预组(0.0 g/L,0.1 g/L,0.2 g/L,0.4 g/L及0.8 g/L);干预时间为72 h,筛选出黄芪多糖干预的最佳浓度点0.Z g/L.试验(2):将培养的实验鼠肾脏肾小球的足细胞分7个组,分别是D-葡萄糖30 mmol/L+黄芪多糖的干预(干预浓度是0.Z g/L),干预的时间分别是0 h,3 h,6 h,12 h,24 h,48 h及72 h;筛选出干预的最佳时间点Y h.试验(3):根据上述试验(1)、(2)结果,将培养的小鼠肾小球足细胞分为:正常对照组、甘露醇高渗对照组、高糖组和黄芪多糖干预组(黄芪多糖的干预浓度是0.Z g/L,干预的时间是Y h),采用流式细胞术与实时聚合酶链反应(real-Time Polymerase Chain Reaction,real-Time PCR)分别检测七组足细胞Nephrin、Desmin蛋白与m RNA的表达.结果随着黄芪多糖干预梯度浓度的递增,实验鼠肾脏肾小球的足细胞Nephrin蛋白表达逐渐上调,Desmin蛋白表达逐渐下调,呈浓度依赖性(P<0.05);随着黄芪多糖干预时间的延长,实验鼠肾脏肾小球的足细胞Nephrin的表达逐渐上调,但肾小球的足细胞Desmin的表达逐渐下调,呈时间依赖性.相比正常对照组和甘露醇高渗对照组,高糖组小鼠肾小球足细胞Nephrin蛋白和m RNA表达均下降,Desmin蛋白和m RNA表达均增加(P<<0.05);而相较高糖组,黄芪多糖干预组Nephrin蛋白和m RNA表达明显上升,Desmin蛋白和m RNA表达明显降低(P<0.05).结论在高糖刺激下,黄芪多糖干预可上调肾小球足细胞Nephrin表达,降低肾小球足细胞Desmin表达,是黄芪治疗DN蛋白尿的可能作用靶点.

离心运动对大鼠骨骼肌线粒体ATP酶活性及desmin表达影响的研究

目的:从细胞内线粒体Ca2+转运系统入手,探讨离心运动对大鼠骨骼肌细胞线粒体ATP酶活性及desmin表达影响,以期进一步揭示骨骼肌运动性损伤的发生机制。方法:雄性SD大鼠96只,体重304g±12g,随机分为安静对照组、运动后即刻组、运动后12h组、运动后24h组、运动后48h组、运动后72h组、运动后5d组、运动后7d组。采用一次性下坡跑训练建立运动损伤模型,取大鼠肱三头肌,部分肌肉做desmin免疫组化切片,并进行定量分析;余下肌肉差速离心提取线粒体,测定线粒体各ATP酶活性。结果:1)离心运动后大鼠骨骼肌desmin表达从运动后即刻到24h呈逐渐下降的趋势,以运动后24h下降最为明显,48h开始回升,第5d达到最高,第7d略有下降,但仍明显高于安静对照组。2)离心运动后即刻大鼠骨骼肌细胞线粒体Ca2+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-AT-Pase的活性显著下降,12h、24h酶活性有所恢复,仍然明显低于安静对照组;48h后各ATP酶结果与安静对照组均无显著差异。结论:大鼠离心运动后骨骼肌细胞线粒体ATP酶活性变化与desmin表达之间存在着某种密切相关的联系,线粒体钙调节失衡是导致骨骼肌运动损伤的一个重要原因;而离心运动后desmin表达的变化,对骨骼肌运动性损伤形态学变化的早期界定和损伤恢复程度的判断具有重要的参考价值。

雷公藤甲素对高糖刺激足细胞synaptopodin和desmin表达影响

目的通过观察高糖刺激对小鼠足细胞synaptopodin和desmin表达影响及雷公藤甲素（TP）对其干预作用,探讨TP减少糖尿病肾病尿蛋白的分子机制。方法以体外培养小鼠永生化足细胞为研究对象,将其分为正常糖组、高糖刺激组、甘露醇对照组、低剂量TP干预组和高剂量TP干预组5组,分别加含有5.5mmol/L的D-葡萄糖、含有30.0mmol/L的D-葡萄糖、含有5.5mmol/L的D-葡萄糖＋24.5mmol/L甘露醇、含有30.0mmol/L的D-葡萄糖＋3μg/L的TP、含有30.0 mmol/L的D-葡萄糖＋10μg/L的TP培养液培养48h。应用荧光定量PCR法和Western Blot方法检测各组足细胞synaptopodin、desmin mRNA和蛋白的表达。结果与正常糖组相比,高糖刺激组足细胞synaptopodin mRNA和蛋白的表达增加,desmin mRNA和蛋白的表达减少;低剂量TP干预和高剂量TP干预组synaptopodin mRNA和蛋白表达水平均较高糖刺激组升高,而desmin mRNA和蛋白表达水平较高糖刺激组降低,且呈一定的剂量-效应关系,差异有显著性（F=25.919~551.012,P〈0.05）。结论 TP可以改善高糖诱导的足细胞synaptopodin和desmin表达异常,这可能是TP减少糖尿病肾病尿蛋白的机制之一。

克山病与Desmin基因突变的关系探讨

目的探讨Desmin基因exon6的A360P错义突变与克山病心肌损伤发生发展的关系。方法采用临床流行病学方法调查,随机抽取年龄、性别相匹配的慢型和潜在型克山病患者,病区正常组和非病区正常组各30例的血样,提取基因组DNA,采用PCR扩增、酶切,电泳等技术比较各组Desmin基因片断酶切位点的变化。结果慢型和潜在型克山病患者与病区正常组未检出Desmin基因exon6的A360P错义突变错义突变位点。结论Desmin基因exon6的A360P错义突变可能不是克山病心肌损伤的易感基因突变。

Desmin在大肠癌与癌旁组织中的表达及意义

目的探讨Desmin在大肠癌与癌旁组织中的的表达及其意义。方法采用液质联用技术对18例新鲜的大肠癌患者的肿瘤组织及癌旁组织检测Desmin的表达情况。结果通过液质联用技术对大肠癌肿瘤组织及癌旁组织进行分离分析,对有差异的蛋白质点进行质谱鉴定,Desmin在癌组织中较癌旁组织中表达降低,并通过免疫印迹进一步验证准确性。结论 Desmin蛋白的低表达可能与大肠癌的癌变有密切的关系。

雷公藤多甙对糖尿病大鼠肾脏Desmin、Synaptopodin表达的影响

目的探讨雷公藤多甙对糖尿病大鼠肾脏Desmin、Synaptopodin表达的影响。方法 30只雄性SD大鼠随机分为对照组(n=10)、糖尿病组(DM组,n=10)、治疗组(n=10)3组。治疗组将雷公藤多甙片以50mg·kg-1·d-1灌胃。于12周末检测24h尿蛋白量、血糖(Glu)、血肌酐(Scr)、血胱抑素C(Cys-C)。HE染色观察肾脏病理改变;免疫组化检测肾脏Desmin、Synaptopodin的表达情况。结果 3组大鼠24h尿蛋白、Scr和Cys-C差异有统计学意义。治疗组24h尿蛋白、Scr和Cys-C均较糖尿病组低(P<0.05),差异有统计学意义。与对照组比较,糖尿病组肾小球体积增大、系膜区基质明显增生、肾小球毛细血管袢受压、基底膜增厚,而治疗组较糖尿病组有所改善。免疫组化显示:3组大鼠肾组织Desmin、Synaptopodin蛋白表达差异有统计学意义,糖尿病组Desmin表达较对照组高、Synaptopodin表达较对照组低(P<0.05);治疗组Desmin表达较糖尿病组低、Synaptopodin表达较糖尿病组高(P<0.05)。结论雷公藤多甙可能通过下调糖尿病大鼠肾脏Desmin的表达、同时上调Synaptopodin表达,保护足细胞,减少尿蛋白,保护肾脏。

Desmin基因exon6 A360P错义突变与克山病的关系

目的探讨Desmin基因exon6的A360P错义突变与克山病心肌损伤发生发展的关系。方法采用临床流行病学方法调查,随机抽取年龄、性别相匹配的慢型和潜在型克山病患者、病区正常组和非病区正常组各30例血样,提取基因组DNA,采用PCR扩增、酶切、电泳等技术比较各组Desmin基因片断酶切位点的变化。结果慢型和潜在型克山病患者与病区正常组未检出Desmin基因exon6的A360P错义突变位点。结论Desmin基因exon6的A360P错义突变可能不是克山病心肌损伤的易感基因突变。

α-SMA和Desmin在大鼠肝纤维化中纤维母细胞的表达

目的:肝脏内存在有两种纤维母细胞,一种是肝星形细胞(hepatic stellate cell HSC),一种是门脉周围的纤维母细胞。用免疫组化方法对这两种细胞群在肝纤维化(hepatic fibrosis HF)中活化后的细胞形态进行组织学鉴别。方法:Wistar系雄性鼠用于实验动物模型制作:CCl4腹腔注射和胆总管结扎(bile duct ligation BDL)诱导肝纤维化动物模型,用SABC法来检测。一次抗体为α-SMA和Desmin。结果:CCl4腹腔注射后48h中央静脉周围的星形细胞在α-SMA和Desmin染色呈强阳性;另外,BDL 96h后门脉区纤维母细胞在α-SMA,染色中显示阳性,而在Desmin染色中未发现有变化。结论:α-SMA在肝星形细胞和门脉区域的纤维母细胞有相同的阳性结果,Desmin被证明能够用于区别有活性的肝星形细胞和门脉区域的纤维母细胞。