我国甘薯E病毒全基因组序列特征及荧光定量检测技术的建立

【目的】甘薯E病毒(sweet potato virus E,SPVE)是甘薯上新发现的一种病毒。本研究对我国甘薯E病毒江苏徐州分离物(SPVE-XZ)的全基因组序列进行测定,分析该病毒基因组序列特征,并建立针对SPVE的荧光定量(quantitative PCR,qPCR)检测技术,为监测SPVE发生分布、检测种薯种苗中SPVE带毒情况并及时防控该病毒提供理论依据和技术支持。【方法】采用small RNA深度测序,结合RT-PCR和RACE技术,获得SPVE-XZ的全基因组序列,利用MegAlign、MEGA11等软件对获得的全基因组序列进行序列比对、系统发育关系分析。设计SPVE荧光定量检测引物,并通过对退火温度及引物浓度的优化,建立针对SPVE的qPCR检测方法,测定其特异性和灵敏度,应用于江苏省和山东省田间甘薯样品的检测。【结果】除ploy(A)外,所获得的SPVE-XZ全基因组序列全长为10919 nt,包含1个长为10560 nt的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码3519 aa的多聚蛋白。5′非翻译区(5′untranslated region,5′UTR)和3′非翻译区(3′UTR)分别为129和230 nt。在P1和P3蛋白内分别包含由移码产生的PISPO和PIPO蛋白。全基因组序列分析表明,SPVE-XZ与韩国SPVE GS分离物(SPVE-GS)全基因组核苷酸一致率最高,为98.6%,多聚蛋白氨基酸一致率为98.5%。利用邻接法基于cp基因核苷酸序列和多聚蛋白氨基酸序列构建的系统进化树发现,SPVE-XZ与SPVE-GS均聚类在一起。建立的SPVE荧光定量检测体系可检测到SPVE,而甘薯病毒2(sweet potato virus 2,SPV2)、甘薯C病毒(sweet potato virus C,SPVC)、甘薯G病毒(sweet potato virus G,SPVG)、甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)、甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)、甘薯潜隐病毒(sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯褪绿斑病毒(sweet potato chlorotic fleck virus,SPCFV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)均未能检测到;灵敏度可达3.12×102 copies/μL,是常规PCR 100倍。应用建立的qPCR检测方法,在山东省采集的6个样品和江苏省采集的52个样品中,分别在1个样品和13个样品中检测到SPVE。【结论】SPVE-XZ的全基因组大小为10919 nt,与韩国SPVE-GS基因组结构一致;建立的qPCR检测体系对SPVE灵敏度高、特异性强,可用于对SPVE的快速检测。

甘薯脱毒试管苗直繁种苗生产技术体系的创建

推广应用甘薯脱毒苗是目前防治甘薯病毒病、提高甘薯产量和品质的唯一有效方法。详细介绍了甘薯脱毒试管苗直繁种苗生产技术体系的创建,主要包括茎尖脱毒培养、试管苗继代扩繁、日光温室扩繁、防虫网塑料大棚扩繁及大田扩繁等技术环节,阐明了河南省甘薯脱毒试管苗直繁种苗具体生产流程,并与常规薯块育苗技术体系进行了比较。甘薯脱毒试管苗直繁种苗生产技术体系中试管苗的扩繁完全在室内进行,全年可灵活安排生产;且种苗繁育过程不经历种薯生产环节,繁育周期大大缩短,减少了种苗感染病毒病的风险,提升了种苗质量。

甘薯病毒种类及甘薯抗病毒策略研究进展

甘薯是重要的粮食作物、工业原料和能源作物.中国是全球最大的甘薯生产国、消费国和出口国.近年来,甘薯病毒病严重危害甘薯种植业的健康发展,因此甘薯病毒种类的鉴定和甘薯抗病毒策略的研究成为前沿问题.文章综述了侵染甘薯的病毒种类、甘薯病毒病检测技术、甘薯茎尖脱毒培养综合处理技术、甘薯抗病毒育种技术等方面的国内外研究进展情况,对甘薯病毒病的多方位防控进行了总结和展望,旨在为甘薯病毒病的有效控制提供理论依据、技术参考和思路借鉴.

脱毒甘薯种源制备及其病毒检测技术优化

为有效解决湛江地区甘薯病毒病影响甘薯品质与产量的问题,采用快速催芽与植物茎尖组织培养技术结合的方式快速繁殖甘薯;运用微茎尖分生组织技术获得甘薯无病毒植株并扩繁;利用试管内靠接、研磨液浸染、无糖培养嫁接、水培嫁接、分子生物学检测等5种方式进行病毒检测,获得无病毒植株和有效的甘薯病毒检测方法。试验结果表明:通过热处理结合微茎尖分生组织技术可有效减少甘薯携带病毒种类,实现甘薯种苗脱毒;试管内靠接、无糖培养嫁接、水培嫁接等3种嫁接方式和分子生物学检测均可有效检测甘薯病毒。

甘薯羽状斑驳病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

【目的】甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)侵染甘薯造成重要危害,本研究旨在利用反转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立一种快速、高效检测SPFMV的方法。【方法】从Gen Bank上获得SPFMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列,利用Primer Explorer V4设计4条RT-LAMP特异性引物SPFMV-FIP(5′-TAAGCGCGGCTGCC TTCATC-CATTCAACCACCCCTGCA-3′)、SPFMV-BIP(5′-TCGGTTGTTTGGTTTGGACGGA-ATCAGTTGTCGTGTGCCTC-3′)、SPFMV-F3(5′-GAGTCTTGCGCGATATGCA-3′)和SPFMV-B3(5′-ACCCCTCATTCCTAAGAGGT-3′),同时设计2条反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)的特异性引物SPFMV-F(5′-TCTAATGAGAACACTGAA TT-3′)和SPFMV-R(5′-TTGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′)。分别设置F3/B3﹕FIP/BIP引物浓度比(1﹕1、1﹕2、1﹕4、1﹕6、1﹕8和1﹕10),d NTPs浓度梯度(0.025、0.125、0.225、0.325、0.425、0.525、0.625、0.725和0.825mmol·L-1),Betaine浓度梯度(0.4、0.7、1.0、1.3和1.6 mol·L-1),反应温度(59、61、63、65、67和69℃)和反应时间(20、30、40、50、60、70、80和90 min),对RT-LAMP反应体系各条件进行优化,确定最佳反应体系。通过测序及酶切对RT-LAMP产物进行鉴定。以携带SPFMV、甘薯C病毒(Sweet potato virus C,SPVC)、甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)、甘薯病毒2(Sweet potato virus 2,SPV2)、甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(Sweet potato virus G,SPVG)、甘薯褪绿斑病毒(Sweet potato chlorotic fleck virus,SPCFV)和健康甘薯叶片的总RNA为模板,分别进行RT-LAMP和RT-PCR特异性检测;带有SPFMV的甘薯总RNA进行10倍梯度稀释,以RNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀释液为模板进行RT-LAMP和RT-PCR灵敏度测定。最后利用优化的RT-LAMP体系对山东省多地采集的SPFMV疑似病样进行检测,加入SYBR green I进行可视化检测。【结果】建立了SPFMV的RT-LAMP快速特异性检测方法,优化的反应体系:引物SPFMV-FIP/SPFMV-BIP为0.8μmol·L-1,SPFMV-F3/SPFMV-B3为0.2μmol·L-1,d NTPs为0.325mmol·L-1,Betaine为1 mol·L-1;65℃反应70 min。特异性试验显示本研究建立的RT-LAMP只对携带SPFMV的RNA能够扩增出典型的梯状条带。RT-LAMP最低可检测的RNA浓度为121.6×10-4 ng·μL-1,而RT-PCR最低能检测的RNA浓度为121.6×10-3 ng·μL-1,表明RT-LAMP的灵敏度比RT-PCR高10倍。田间样品检测,RT-LAMP扩增结果与可视化检测结果一致,表明本研究建立的RT-LAMP快速检测方法可有效应用到SPFMV的田间检测。【结论】建立的RT-LAMP快速检测方法灵敏度高、特异性好,适用于SPFMV的田间快速检测。

河南省甘薯脱毒技术研究及其应用

利用茎尖分生组织培养技术 ,对河南省 1 0个主栽甘薯品种进行了脱毒培养 ,经过对脱毒甘薯原原种、原种及良种的三级繁育和在生产上大面积应用 ,结果表明 :脱毒甘薯比非脱毒甘薯平均增产 6 1 .8%,商品性状明显改善。此外 ,还对河南省甘薯病毒种类进行了鉴定 ,明确了甘薯羽状斑驳病毒 (SPFMV)、甘薯潜隐病毒 (SPLV)和甘薯G病毒 (SPVG)等为河南省甘薯主要病毒 ,并对甘薯茎尖苗病毒快速检测技术进行了研究。

反向斑点杂交法快速检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯G病毒

【目的】以克隆得到的甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯G病毒(Sweet potato virus G,SPVG)基因片段为探针建立反向斑点杂交技术体系,应用于甘薯组培脱毒苗带毒情况检测,为生产优质甘薯组培脱毒苗提供保障。【方法】根据已公布的侵染甘薯的SPFMV和SPVG的核苷酸序列设计两对特异引物,以RT-PCR法从染病的甘薯叶片扩增SPFMV和SPVG的两个片段,并以克隆到的两个病毒片段及内参基因Actin片段为探针建立反向斑点杂交体系。【结果】分别克隆出长度约310和500 bp的片段,经BLAST比对,所获得的310 bp片段为SPFMV的外壳蛋白基因片段,同源性为97%,500 bp片段为SPVG的外壳蛋白基因片段,同源性为99%。分别用带有SPFMV和SPVG片段的重组质粒pUC-SPFMV和pUC-SPVG进行反向斑点杂交,发现不同病毒能获得单一信号,无交叉现象。以染病甘薯和脱毒甘薯苗为样品,用该种病毒的探针进行反向斑点杂交,染病植株样品中能获得单一信号,而脱毒苗甘薯样品未见任何信号,杂交结果与RT-PCR检测结果一致。【结论】用建立的反向斑点杂交技术体系能有效检测甘薯中的SPFMV和SPVG,无交叉信号,可用于甘薯组培脱毒苗的前期检测。

马铃薯茎尖脱毒技术体系的研究进展

马铃薯茎尖脱毒技术的应用是克服马铃薯病毒病和类病毒病害的主要措施之一。系统总结了茎尖脱毒技术体系中的脱毒、快繁、种薯诱导和检测技术的影响因素和研究进展,主要包括茎尖大小、外源激素、温度、光照、环境、培养基等因素以及RT-PCR检测技术等,还分析了脱毒马铃薯增产的机理,并展望了该技术今后研究方向。

紫色甘薯的茎尖培养与脱毒

以紫色甘薯品系为试材,研究6-BA和NAA及基因型对紫色甘薯茎尖培养的影响,并采用硝酸纤维素膜—酶联免疫法(NCM-ELISA)和症状法对再生植株进行病毒学检测。结果表明,培养基中6-BA和NAA浓度和配比对紫色甘薯茎尖培养的愈伤组织、不定根和不定芽的诱导有明显影响。6-BA可促进不定芽的诱导,附加1mg/L6-BA的MS培养基为最佳诱芽培养基。基因型对诱芽率也有一定的影响,其中品系B3和B7的诱芽率可达50%。通过病毒学检测,获得12个紫色甘薯品系的脱毒苗,其平均脱毒率为94.7%。

侵染甘薯的SPCSV、SPVG、SPFMV多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立可同时检测甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）、甘薯G病毒（SPVG）和甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）多重RT-PCR检测方法,本文根据SPCSV热激蛋白基因（hsp70）及SPVG、SPFMV外壳蛋白基因（CP）基因核苷酸序列的保守区域设计特异性引物,通过引物筛选,优化多重RT-PCR反应条件,建立了能同时检测SPCSV、SPVG和SPFMV 3种病毒的多重RT-PCR检测方法。该体系能有效扩增出大小为304、433、601 bp 3个特异性片段。测序结果表明3种病毒与参考序列的一致性达94%-99%。应用建立的多重RT-PCR检测方法可稳定、准确、灵敏地同时检测单一或复合侵染3种甘薯病毒,为甘薯脱毒和病毒病诊断奠定基础。

日本紫色甘薯常见病毒病的检测

采用硝化纤维素膜酶联免疫吸附检测法 (NCM -ELISA)和症状诊断法 ,对从日本引进的紫色甘薯病毒病发生情况进行检测。NCM -ELISA检测结果表明 ,从日本引进的紫色甘薯分别感染了甘薯羽状斑驳病毒 (SPFMV)、甘薯轻度斑驳花叶病毒 (SPMMV)、甘薯褪绿斑点病毒 (SPCFV)、甘薯潜隐病毒 (SPLV)、C - 6病毒和C - 8病毒。其中 ,SPFMV和SPMMV感染最普遍 ,SPCFV和SPLV次之 ,而C - 6和C - 8感染较少。在供试的 14个日本紫色甘薯品种 (系 )中 ,A4、A5和山川紫等 3个品系 (种 )感染上述全部 6种病毒 ,其余 11个甘薯品系只是感染了其中几种病毒 ;症状观察结果表明 ,感染病毒的紫色甘薯叶片出现明显的症状 ,主要表现为褪绿斑驳、畸形、坏死、变色等 4种类型。

甘薯褪绿矮化病毒西非株系RT-LAMP检测方法的建立

【目的】基于逆转录环介导等温扩增技术(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)西非株系(West African,WA)的可视化检测方法。【方法】针对SPCSV西非株系(SPCSV-WA)的CP核苷酸序列设计4条引物,以感染SPCSV-WA甘薯叶片总RNA为模板,进行一步法RT-LAMP,在65℃条件下反应1 h。扩增产物利用琼脂糖电泳分析和SYBR green I荧光染料显色判断结果,同时对扩增产物的电泳条带进行基因克隆和测序鉴定。利用常规RT-PCR和建立的RT-LAMP方法对14份甘薯样品进行SPCSV-WA检测,比较2种方法的检测结果。【结果】建立的LAMP方法可特异地对SPCSV-WA进行检测,且最低可检测出101拷贝/μL的模板。RT-LAMP产物的克隆测序表明,感染SPCSV-WA甘薯样品的RT-LAMP产物为SPCSV-WA CP基因序列。14份田间甘薯样品检测表明,RT-LAMP与RT-PCR方法检测结果完全一致。【结论】建立的SPCSV-WA RT-LAMP可视化检测方法,是简便、可靠的SPCSV-WA检测方法。

重庆市主栽优良甘薯品种的茎尖培养脱毒研究

选用重庆市大面积推广的优良甘薯品种进行茎尖脱毒离体培养试验.结果表明:对来源于薯块萌发芽的茎尖进行组织培养,其成苗率最高,达53.2%;连续两次进行茎尖培养可明显增强脱毒效果;对于甘薯病毒病的检测,反转录PCR法(RT-PCR)比硝化纤维素膜酶联免疫吸附检测法(NCM-ELISA)更灵敏和可靠.

叶原基形态对甘薯茎尖脱毒培养的影响

以带有甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）的渝薯2号，从其块根萌芽上剥取2叶原基形态分别处于突起态、半闭合态和闭合态0．22～0．35mm大小的茎尖为外植体，培养于附加BAP与IAA，BAP与NAA不同激素体积质量分数组合的MS培养基上进行成苗培养，对应再生株系用硝酸纤维素膜酶联免疫吸附检测法（NCMELISA）进行病毒检测．结果表明：茎尖培养最佳的激素体积质量分数组合为0．8～1．4mg／L BAP＋0．01mg／LNAA，有利于茎尖基部发生少量的愈伤组织，芽粗壮且成苗快．成苗率因外植体而不同，闭合态和半闭合态较高，分别达92．9％和88．9％，而突起态成苗率仅为46．7％．脱毒效果也与外植体相关，最佳效果是叶原基突起态，其次是半闭合态和闭合态，分别获得100％，83．9％和71．9％的脱毒植株．

甘薯茎尖培养与脱毒技术研究

以红姑娘2号甘薯为材料,研究6-BA、NAA、GA3不同配组对茎尖培养的影响,并采用温水钝化法及适宜的茎尖大小来提高红薯病毒脱毒率,用指示植物法对再生植株无性系进行病毒检测。研究结果表明,培养基中的6-BA、NAA、GA3不同浓度配比对红姑娘2号甘薯茎尖培养不定芽、不定根的诱导有明显的影响。在诱导产生愈伤组织和丛芽阶段,培养基MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.01mg/L+GA3 0.1mg/L效果较好。而1/2MS+NAA 0.2mg/L是红姑娘2号试管苗的适宜生根培养基。通过指示植物法检测90个无性系,平均脱毒率为96.7%。

甘薯卷叶病毒的RPA检测方法的建立

【目的】建立快速检测甘薯卷叶病毒重组酶聚合酶(RPA)等温扩增方法,为甘薯卷叶病毒(sweet potato leaf curl virus,SPLCV)提供快速、简便的检测方法。【方法】根据甘薯卷叶病毒AV1基因的保守区段设计RPA检测用引物,并对引物进行筛选,对反应条件和反应体系进行优化,建立SPLCV的RPA检测方法。【结果】建立的甘薯卷叶病毒RPA方法快速简便,39℃反应20 min完成检测;灵敏度高,最低检测限为10 pg·μL^(−1);特异性强,与感染番茄黄化卷叶病毒(TYLCD),甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯G病毒(SPVG)、甘薯退绿矮化病毒(SPCSV)等4种DNA病毒均无交叉反应。【结论】建立的RPA检测方法具有快速、灵敏、特异性强、不需要特殊仪器等优点,适合田间甘薯卷叶病毒样品的快速检测。

甘薯脱毒苗病毒嫁接检测技术研究

对脱毒茎尖苗嫁接检测方法进行了研究。结果表明 :以巴西牵牛作为砧木指示植物 ,其播种嫁接时间可在春秋两季进行 ,在砧木的 1～ 6片真叶期均可采用插接法和靠接法进行嫁接检测。

几种因素对甘薯龙薯9号茎尖脱毒的影响

为满足生产上对龙薯9号不带病毒种苗的需求,进行龙薯9号茎尖脱毒组织培养研究。通过正交试验筛选龙薯9号的茎尖组织培养的最佳培养基;以MS为基础培养基,分别添加6-BA、NAA和GA3进行组培苗快速繁殖培养基的筛选;采用指示植物巴西牵牛检测脱毒苗的带病率。结果表明:茎尖组织培养的最优培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.02mg/L+GA3 0.2mg/L+蔗糖30g/L;快繁培养的最佳培养基为MS+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L;指示植物巴西牵牛检测龙薯9号脱毒苗是否带毒的最佳时期为5-6月,选用植株的中部为接穗可以提高检测效果。

脱毒甘薯试管苗三角瓶内外快繁的研究

以脱毒甘薯豫薯 8号试管苗为试材 ,对三角瓶内外的快繁进行了研究。结果表明 :三角瓶外快繁不仅能降低成本 ,省时省工 ,而且在苗的质量上也优于三角瓶内快繁 ,移栽到大棚后 ,适应快 ,长势好 ,成活率高。

脱毒甘薯组培苗水培营养液配方筛选

采用水培方法,研究了4种营养液配方:MS营养液大量元素配方(Ⅰ),霍格兰和阿农营养液通用配方1938年(Ⅱ),循环水生菜营养液配方(Ⅲ),MS营养液大量元素调整配方(Ⅳ)对脱毒甘薯组培苗的影响。试验结果表明,处理Ⅱ脱毒甘薯的地上部鲜质量和干质量、根鲜质量和干质量、枝长、每一枝条节数均为最大。处理Ⅱ与处理Ⅲ、Ⅳ相比,地上部鲜质量分别提高4.1,25.1倍,干质量分别高4.6,10.4倍;根鲜质量分别高4.4,17.8倍,根干质量分别高3.5,11.4倍,枝长分别高1.2,2.9倍,每一枝条节数分别高0.4,1.0倍,除与处理Ⅲ的每一枝条节数外,以上差异均达显著水平。霍格兰和阿农营养液通用配方1938年是水培繁殖脱毒甘薯种苗的适宜配方。