滇南小耳猪肌源性因子5(MYF5)基因多态性研究

肌源性因子5(myogenic factor 5,MYF5)被认为是猪肌肉生长发育的重要基因,为探究MYF5基因的遗传变异对滇南小耳猪生长性状的影响,以期为优质滇南小耳猪肉新品种(系)培育提供有效的分子遗传标记,本试验以MYF5为候选基因,杜洛克猪(n=40)为对照组,筛选滇南小耳猪(n=18)的优势SNP位点,并对筛选的优势SNP与其主要胴体及肉质性状进行关联分析。结果显示,在滇南小耳猪MYF5基因检出的16个SNP位点中,1个位于编码区,为同义突变,并筛选到4个优势SNP。关联分析结果表明,滇南小耳猪MYF5基因1486、1574、1629以及1701位点间突变频率一致且有相近的遗传图距,连锁紧密。A1486G位点分别为GG、AG、AA基因型;G1574A位点分别为AA、GA、GG基因型;C1629T位点分别为TT、CT、CC基因型;T1701C位点分别为CC、TC、TT基因型。就肌内脂肪含量而言,MM基因型极显著高于MN基因型(P<0.01),MM基因型显著高于NN基因型(P<0.05),NN基因型显著高于MN基因型(P<0.05)。就大理石纹评分而言,MM基因型极显著高于NN基因型(P<0.01),MM基因型极显著高于MN基因型(P<0.01),MN基因型极显著高于NN基因型(P<0.01)。因此,本研究可基本推断在有关作用于滇南小耳猪种肉质性状的基因中,MYF5基因较为关键。该试验结论可为滇南小耳猪育种中改善肉品质等性状给予分子标记支撑。

滇南小耳猪细胞生成素(MyoG)基因多态性的研究

以猪肌细胞生成素(MyoG)基因序列设计引物,采用PCR产物直接测序技术对48头滇南小耳猪和40头杜洛克的MyoG基因外显子序列进行测定和分析。发现滇南小耳猪MyoG基因有12个多态位点,其中3个位于编码区属于同义突变,有7个突变位点为优势突变。与屠宰测定的结果进行关联分析,结果表明:滇南小耳猪MyoG基因2 041,2 047位点多态性对瘦肉率有极显著影响(P<0.01),对背膘厚和pH24有显著影响(P<0.05);MyoG基因1 655,1 688位点多态性对瘦肉率和pH24有显著影响(P<0.05),对背膘厚有极显著影响(P<0.01);结合前人的研究结果,可以初步推测MyoG基因是影响滇南小耳猪肉质性状的主效基因或是与影响滇南小耳猪胴体、肉质性状的QTL连锁的基因。实验结果可以为猪育种中提高瘦肉率等性状提供分子依据。

利用76个微卫星标记分析滇南小耳猪的遗传多样性

滇南小耳猪是云南省优良地方猪种之一，其数量大，分布广。为了阐明其群体遗传变异情况，以对其进一步有效保护和合理利用提供科学依据，本研究采用分布在家猪19条染色体上的76个微卫星标记对该猪群体54个个体进行了群体遗传变异检测。共检测到338个等位基因，每个座位的等位基因数在2～8个之间，有效等位基因数在1．9560～5．71432：间，平均每个座位等位基因数（4．4474±1．2044）个，有效等位基因数（3．5091±0．9197）个，群体平均杂合度及平均多态信息含量分别为0．6917±0．09797和0．6388±0．1142。研究结果表明，滇南小耳猪群体遗传多样性较丰富。

滇南小耳猪遗传多样性的血液蛋白电泳研究

本文采用蛋白电泳技术研究滇南小耳猪血液蛋白多态性。共分析了滇南小耳猪３２个遗传位点，其中ＡＫＰ、ＣＡＴ、ＥＳ、ＰＡ、６ＰＧＤ和ＴＦ等６个位点检测到多态性，多态位点百分比Ｐ＝０．１８７５，平均杂合度Ｈ＝０．０７１２。结果表明滇南小耳猪的血液蛋白多态程度较高，反映在蛋白质水平上的遗传多样性较为丰富。

猪新基因PFN3电子克隆、RT-PCR验证和组织表达分析

通过NCBI下载猪近缘物种的PFN3基因序列,在线BLAST比对获得猪EST序列,利用Lasergene软件电子克隆猪PFN3基因编码区序列及部分侧翼序列。针对编码区设计特异引物并以滇南小耳猪为研究材料进行实验验证,同时应用半定量RT-PCR技术对30个组织进行了表达分析。研究获得了猪PFN3 414 bp的编码区序列(GenBank登录号:JX457348,对应的氨基酸登录号:AFU74013)。生物信息学分析表明,该基因编码137个氨基酸,预测的蛋白质分子量(Mw)为14.73 ku,等电点(pI)为9.30。蛋白质结构分析显示,PFN3存在1个保守域,无信号肽;疏水性分析表明其N端和C端均具有亲水性;亚细胞定位显示,该蛋白位于细胞质的概率是94.1%。系统进化分析表明,猪与牛亲缘关系最近。组织表达分析表明,PFN3基因在30个被检组织中均有表达,在睾丸、肝、肾、结肠、盲肠、直肠及食管中高表达,在胸腺、甲状腺、附睾、淋巴结、十二指肠、空肠、回肠、胃、皮肤、大脑、小脑、垂体及下丘脑中中度表达,在颌下腺、肺、心、脾、肾上腺、肌肉、胰脏、脑干、舌下腺及脊髓中低表达。研究结果将为该基因在猪中的进一步功能研究奠定基础。

封闭群滇南小耳猪体重和脏器重量的测定及其相关性分析

目的测定5～6月龄滇南小耳猪体重、脏器重量,并对其进行相关分析.方法选用5～6月龄封闭群滇南小耳猪24只,雌雄各半,分别测定体重和17个脏器和腺体重量,计算脏器系数,通过SPSS软件进行脏器系数的性别间比较和脏器重量与体重间的相关性与回归分析.结果封闭群小耳猪脏器重量雌雄间仅肺脏差异有统计学意义(P<0.05);脏器系数雌雄间仅有肺系数和颌下腺系数差异有统计学意义(P<0.05).体重和脏器重量相关分析表明,雄性滇南小耳猪体重与心、脾、胰腺、腮腺有相关性(P<0.05);雌性的体重与心、膀胱有相关性(P<0.05),进一步的回归分析显示,雄性的心、脾、胰腺、腮腺,雌性的心、膀胱与体重呈线性相关(P<0.05).结论封闭群滇南小耳猪主要脏器系数性别间差异小,其体重与某些脏器重量存在一定的线性关系.

滇南小耳猪电刺激采精及精子功能的检测

采用Lane PulsatorⅣ型直肠电刺激采精法对滇南小耳猪进行采精,采精仪电压参数设为4～5档,电刺激时间1～5 s,在麻醉情况下成功采精。据精液的色泽,明显分为3段:前段清亮(精液量28±12 mL;密度(2.5±1.2)×10~6个·mL^(-1);活力18.2±5.8)%,中段为胶冻絮状液体(26±14 mL;(4.7±3.9)×10~8个·mL^(-1);(69.3±15.4)%)和后段清亮(22±10 mL;(5.8±5.3)×10~6个·mL^(-1);(35.4±12.2)%)。与间隔3 d和14 d重复采精比较,间隔7 d采精的效果较好,中段精液的品质较好。中段精液对超教排卵母猪的人工授精实验中,卵子受精率为81.3%,囊胚率达到71.9%。直肠电刺激采精方法是适用于滇南小耳猪的安全有效的采精技术。

滇南小耳猪血液生理生化部分指标测定

目的测定正常3～6月龄和8～12月龄封闭群滇南小耳猪血液生理与生化各项指标.方法常规方法检测滇南小耳猪18项血液生理指标、30项血液生化指标,统计各指标间的性别差异及两年龄段同类指标的对比分析.结果性别间绝大多数血液生理与生化指标差异不显著.3～6月龄血液生理与生化雌雄间比较,各指标差异均无统计学意义(P>0.05);8～12月龄血液生理雌、雄间HGB、RBC、HCT、MONO%和MONO有差异(P<0.05),雌雄间血液生化ALT、TBA、CHO、TG、LDL-C、APOB和CL有差异(P<0.05);两个年龄组雌雄合并相比,血液生理WBC、PLT、MPV、LY、MCHC、NEUT%和NEUT等7项指标有差异(P<0.05),生化指标ALB、UREA、HDL-C、GLU、APOA和FE等6项指标差异有统计学意义(P<0.05).结论滇南小耳猪两个年龄段之间以及雌、雄之间部分血液生理生化指标存在明显差异可为滇南小耳猪的标准化研究和相关实验研究提供基础资料和数据.

初情期前云南滇南小耳猪超数排卵和原核期胚胎体外发育的研究

目的对初情期前云南滇南小耳猪超数排卵和原核期胚胎体外发育进行研究.方法对8头初情期前云南滇南小耳猪注射1000IUPMSG和500IUhCG诱导超数排卵,以自然交配和人工授精技术、手术或离体冲卵技术回收原核期胚胎,并进行胚胎体外培养研究.结果超排的激素处理方法可成功诱导超生理数量的卵子发育和排卵及受精,最多可得到31枚受精卵.受精卵的囊胚率可达到87.5%.经过比较研究,人工授精可能优于自然交配的授精方式;雌激素可作为初情期前小母猪的超排成败的重要标志.但是,手术法冲卵的技术较离体冲卵的还很低.结论初情期云南滇南小耳猪可用于体内胚胎生产,其原核期胚胎体外发育具有比较高的的发育潜能.

滇南小耳猪精液的直接冷冻保存

目的建立滇南小耳猪精液冷冻保存方法,加速云南省特有小型猪种的小型化选育。方法利用脉冲电刺激模式诱导公猪输精管自助收缩排精。利用直接冷冻新技术(DFM)研究不同冷冻方案对精子的运动度、精子顶体完整性和体内授精胚胎发育能力的影响。结果在直接冷冻方法中,3%甘油防冻剂的作用下,60 s植冰时间和1.5 mm/s的冷冻降温参数对精子运动度保护良好,精子运动复苏率达到61.7%。但是,3%乙二醇虽然与甘油一样对精子的顶体完整性都有很好的保护作用,对精子运动度保护能力较差。此外,3%甘油、60 s植冰、1.5mm/s冷冻速度的直接冷冻的冻精解冻,移植到超数排卵的母猪子宫颈口实施人工授精,获得卵的受精和胚胎发育潜能尚可。结论玻璃管直接冷冻可以完成滇南小耳猪精子的冷冻保存。

滇南小耳猪胆道成纤维细胞的培养鉴定

目的探索滇南小耳猪胆道成纤维细胞的培养方法,为进一步研究胆道良性狭窄奠定基础。方法用滇南小耳猪建立胆道损伤模型,用组织贴壁法,并尝试了不同的培养基和胎牛血清浓度后,探索出成熟的滇南小耳猪胆道成纤维细胞的培养方法,并用细胞免疫荧光化学检测波形蛋白和结蛋白鉴定为成纤维细胞。结果组织贴壁法可以培养出可以传代的胆道成纤维细胞。结论胆道成纤维细胞是一种具有增生和多向分化潜能的细胞,较难培养传代,其成功培养为下一步药物干预的研究打下良好基础。

滇南小耳猪生长激素基因多态性研究

目的探讨滇南小耳猪生长激素基因多态性,为滇南小耳猪的选育提供分子标记辅助选择的依据.方法采用PCR-RFLP方法对滇南小耳猪GH基因的ApaⅠ酶切位点多态性进行了分析.结果检测到两种基因型AA和AB,AB型的频率高子AA型.没有检测到BB基因型个体.等位基因A的基因频率高于等位基因B,等位基因A在群体中占优势.结论滇南小耳猪群生长激素基因具有较丰富的多态性.

滇南小耳猪与DLY商品猪背最长肌营养成分比较分析

本试验为比较研究滇南小耳猪与DLY商品猪肉的营养价值,分别检测了53头滇南小耳猪和58头DLY猪背最长肌肉的水分、粗蛋白质、粗脂肪、灰分、氨基酸及脂肪酸等营养成分含量,比较分析其差异性。结果显示,滇南小耳猪背最长肌的水分含量极显著低于DLY商品猪背最长肌(P<0.01),粗蛋白质、粗脂肪含量极显著高于DLY商品猪(P<0.01),灰分含量差异不显著(P>0.05);其中滇南小耳猪背最长肌的7种必需氨基酸(苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸、顺式异油酸、11-顺-二十碳烯酸,饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、总脂肪酸含量均极显著高于DLY商品猪(P<0.01)。综上所述,滇南小耳猪与DLY猪相比具有更高的营养价值和开发价值。

育肥方式对滇南小耳猪脂肪酸组成的影响

为研究育肥方式对滇南小耳猪脂肪酸含量的影响以生产优质猪肉,按规模化养殖、"吊架子"和"全放养加补饲"等3种育肥方式进行滇南小耳猪育肥试验,测定其背最长肌、背脂、腹脂的脂肪酸含量。结果显示:农村"吊架子"育肥组和"全放养加补饲"育肥组油酸、单不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸含量分别比规模化养殖育肥组高2.27%、0.86%、9.19%(P<0.01)和9.46%、9.34%、7.23%(P<0.01),亚油酸、亚麻酸、多不饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸含量分别比规模化养殖育肥组低24.30%、83.62%、31.00%、6.90%(P<0.01)和49.65%、71.19%、51.33%、5.41%(P<0.01)。"吊架子"育肥和"全放养加补饲"育肥会导致滇南小耳猪油酸、饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸升高,亚油酸、亚麻酸和多不饱和脂肪酸降低。对滇南小耳猪等地方猪种,在产区条件许可时可适当选用"吊架子"乃至"全放养加补饲"的育肥方式以生产高油酸、低亚油酸的优质保健型猪肉以提高养殖效益。

育肥方式对滇南小耳猪肌肉氨基酸的影响

为探讨育肥方式对滇南小耳猪肌肉风味氨基酸的影响以生产优质猪肉,模拟产区规模养殖场(对照组)、"吊架子"(试验Ⅰ组)和"放养+补饲"(试验Ⅱ组)3种方式进行育肥试验,屠宰并测定其肌肉氨基酸含量,比较呈味氨基酸含量及味道强度值。结果显示:试验Ⅰ组和Ⅱ组肌肉的鲜味、甜味氨基酸总量分别比对照组提高11.65%、10.56%(P<0.05)和14.52%、14.12%(P<0.05),鲜味、甜味、酸味强度值分别比对照组提高11.85%、11.35%、12.82%(P<0.05)和14.76%、14.57%、15.46%(P<0.05)。滇南小耳猪肌肉中鲜味、酸味贡献最大氨基酸是谷氨酸,甜味、苦味贡献最大的是组氨酸。"吊架子"和"放养+补饲"2种育肥方式可提高滇南小耳猪肌肉呈味氨基酸含量和呈味强度,显著增强丙氨酸的鲜味及甜味味道强度值。

滇南小耳猪与云南野猪SLA-DQA基因的多态性比较

目的 分析滇南小耳猪与云南野猪（S.s.silvianus） SLA-DQA基因不同酶切位点的基因型多态性以及等位基因的多态性,检验这些酶切位点上的基因频率是否达到Hardy-Weinberg平衡.方法 采用EcoRⅠ和AluⅠ两种限制性内切酶对滇南小耳猪和云南野猪SLA-DQA第1和第2内含子部分序列以及完整的外显子2进行PCR-RFLP分析.结果 在EcoRⅠ与AluⅠ酶切位点上均得到3种基因型,在这两个酶切位点上版纳系有9种组合基因型,明光系有8种组合基因型,而野猪仅发现4种组合基因型.经x2适合性检验表明：滇南小耳猪SLA-DQA外显子2在EcoRⅠ与Alu Ⅰ酶切位点上均未达到Hardy-Weinberg平衡状态（P＜0.05）,但明光系和云南野猪在两酶切位点均达到了平衡状态（P＞0.05）.结论 滇南小耳猪SLA-DQA在EcoRⅠ与AluⅠ酶切位点均表现为中度多态,云南野猪在EcoRⅠ为中度多态,在Alu Ⅰ酶切位点则为低度多态；滇南小耳猪的HardyWeinberg不平衡主要来自版纳系小耳猪.

云南三个地方猪种肌肉脂肪酸组成分析

为了分析不同地方品种猪肌肉脂肪酸含量差异,对云南3个地方猪种大河乌猪、撒坝猪和滇南小耳猪背最长肌脂肪酸含量进行了测定与分析。结果表明,滇南小耳猪和大河乌猪的饱和脂肪酸极显著高于撒坝猪(P<0.01),而撒坝猪的多不饱和脂肪酸极显著高于大河乌猪和滇南小耳猪(P<0.01),其中,撒坝猪单不饱和脂肪酸含量最高(50.58%),而滇南小耳猪的多不饱和脂肪酸含量最高(15.28%),表明云南地方猪种特别是滇南小耳猪肉质优良。本研究为云南地方猪种作为育种、杂优利用素材的推广以及遗传资源保护提供了肉质特性方面的基础资料。

云南滇南小耳猪与广西巴马小型猪mtDNA D-Loop的初步研究

目的研究封闭群滇南小耳猪与广西巴马小型猪线粒体DNA（mtDNA）的多态性，探索小型猪遗传监测的方法。方法用18种限制性内切酶对23头滇南小耳猪和21头广西巴马小型猪mtDNA D-loop的PCR产物进行RFLP分析。结果滇南小耳猪和广西巴马小型猪的mtDNA D—loop在品种内和品种间均表现出相同的酶切图谱，未见多态性。结论滇南小耳猪与广西巴马小型猪mtDNA D—loop的遗传多样性贫乏，mtDNA PCR—RFLP技术在其遗传监测中不具应用价值。

猪心肺联合移植模型的建立

目的总结7例滇南小耳猪心肺联合移植模型建立实验研究的手术操作技术、供体心肺的保护、术后各常见并发症的观察和处理等相关问题,建立动物心肺联合移植实验模型,为更多科研项目的开展提供基础.方法 2009年1月至2010年2月对14只实验用滇南小耳猪进行心肺联合移植.结果 7例手术成功,获得短期存活,基本达到研究目的,成功建立实验动物模型.结论滇南小猪的实验研究为临床开展心肺联合移植提供了实验资料。

滇南小耳猪繁殖性状的相关及通径分析

本研究对120头滇南小耳猪的产总仔数(X_1),产活仔数(X_2),出生窝重(X_3),出生均重(X_4),35日龄断奶仔数(X_5),35日龄断奶个体重(X_6),35日龄断奶窝重(Y),7个繁殖性状进行了相关分析和通径分析,为其早期选种提供理论依据。研究结果表明,各个繁殖性状在表型值上都存在不同程度的相关,其中总产仔数(X_1)与产活仔数(X_2)相关系数最大(0.89402),而35日龄断奶个体重(X_6)和35日龄断奶仔猪数(X_5),对35日龄断奶窝重(Y)有极显著的影响(P<0.01),在此基础上,建立估计35日龄断奶窝重(Y)的最优回归方程为Y=4.3576-0.59901X_5+0.1375X_6。