骨髓干细胞移植对dystrophin/utrophin基因双敲除鼠骨骼肌微观结构的影响

【目的】研究骨髓干细胞移植对Duchenne型肌营养不良(DMD)鼠(dko鼠)的骨骼肌微观结构的影响。【方法】获取4～5周龄C57BL/6鼠骨髓干细胞,体外培养3d,以1.2×107个细胞/只静脉移植到7Gyγ射线预处理的6只dko鼠(7～8周龄)。8周后,检测移植鼠肌肉组织dystrophin蛋白表达、显微以及超微结构改变,并比较两组生存期。【结果】6只dko鼠骨髓干细胞移植8周后,约有7%骨骼肌肌纤维表达了dystrophin蛋白,骨骼肌组织的显微及超微结构有了一定的改善,治疗组生存期有明显延长。【结论】静脉移植同种、同系鼠骨髓干细胞的dko鼠,8周之后,部分骨骼肌细胞有缺失蛋白的表达、其微观病理变化有了一定改善,生存期得到延长;提示干细胞移植治疗DMD有效。

骨髓间质干细胞移植治疗假肥大型肌营养不良症模型鼠后运动功能的改善

目的观察骨髓间质干细胞(MSC)移植治疗假肥大型肌营养不良症(DMD)动物模型dko鼠后运动功能的改善情况。方法用体外培养传代扩增纯化的第5代(P5)MSC经鼠尾静脉移植治疗dko鼠,在细胞移植治疗后15周分别对实验组与对照组dko鼠进行牵引、转棒、转轮、倒挂、翻身、走步的一系列运动功能测试观察(录像记录),并取dko鼠后肢腓肠肌组织做荧光免疫组化检测抗肌萎缩蛋白(dystrophin/utrophin)的表达,计算阳性肌纤维的平均吸光度值并进行统计学分析。结果传3代以上呈集落生长的MSC均一性好,静脉移植免疫反应低,移植后15周实验组dko鼠肌膜组织有dystrophin/utrophin免疫荧光表达,而对照组则无免疫荧光表达,两组有显著差异(P<005);MSC移植后15周实验组dko鼠的系列运动功能测试均显著优于对照鼠(P<005)。结论MSC移植对dko鼠肌萎缩组织有一定的修复与再生作用,并能改善DMD模型鼠的主动与被动运动功能。

Utrophin+/-mdx鼠子代的基因型鉴定

[目的]对utrophin基因+/-mdx鼠(简称杂合子鼠)的子代进行基因鉴定。[方法]从杂合子鼠子代鼠尾提取DNA,对其正常和异常的utrophin基因片段扩增,电泳后观察结果。[结果]27只杂合子鼠子代鼠中,鉴定出7只mdx、14只杂合子、6只dystrophin/utrophin基因双敲除鼠,依次约占总数的1/4、1/2和1/4。[结论]本实验方法能够精确鉴定出mdx、杂合子和dko鼠,为DMD进一步的实验研究提供了有效的手段。

Duchenne型肌营养不良小鼠模型鉴定及干细胞移植后dystrophin的变化

目的建立Duchenne型肌营养不良(DMD)模型dko小鼠的鉴定方法,评估干细胞移植后dystrophin的再生水平。方法采用SSP-PCR方法鉴定杂合子鼠交配产生的子代鼠的基因型。生化分析仪测定dko小鼠血浆肌酸激酶含量,HE染色观察肌肉组织学变化。扩增人脐带间充质干细胞并注射到dko小鼠后肢肌肉,2个月后免疫荧光染色法检测dystrophin的表达。结果杂合子鼠交配可以产生三个基因型的子代鼠,21.2%的子代鼠可以鉴定为dko小鼠的基因型(285 bp)。dko小鼠显示了肌营养不良的症状,血浆肌酸激酶含量高达(16,988.52±617.48)IU/L,典型的病理变化包括肌纤维大小不一,多见核中移细胞,结缔组织增生或炎性细胞浸润。将人脐带间充质干细胞注射到dko小鼠后肢肌肉,2个月后可检测到人dystrophin的表达。结论采用SSP-PCR可用于鉴定dko小鼠基因型,dko小鼠是研究干细胞治疗DMD的理想动物模型。

presenilin-1/presenilin-2双基因敲除小鼠的寿命观察

目的观察Presenilin-1/Presenilin-2双基因敲除小鼠(dKO mice)的生存曲线,为进一步繁殖及使用该模型对阿尔茨海默病(AD)进行研究提供实验设计等提供参考。方法将dKO mice雌性50只,雄性30只,及野生型同系小鼠雌、雄各20只分为4组,观察正常喂养情况下4组间小鼠2年以内各自的生存情况及寿命,绘制生存曲线进行生存分析。结果 dKO mice随着时间的延长,雌、雄性生存概率分别低于野生型雌、雄性小鼠,差异均有统计学意义(P<0.001,P<0.001;P<0.001;P<0.001);dKO mice雌、雄性之间的生存概率差异无统计学意义。结论条件性敲除presenilin-1与presenilin-2双基因可能会缩短小鼠的寿命,其生存概率显著低于野生型小鼠,而dKO mice雌、雄性之间的生存概率则无统计学差异。本实验结果可为借助此模型的实验设计应用提供有益参考。

阿尔茨海默病presenilin-1/presenilin-2双基因敲除小鼠海马Ptprd基因甲基化改变

目的探讨Ptprd基因在中期阿尔茨海默病小鼠模型(presenilin-1/presenilin-2条件性双基因敲除小鼠,d KO小鼠)海马组织甲基化改变情况。方法取12月龄雌性d KO小鼠3只和12月龄雌性CBAC57小鼠3只分别作为实验组和对照组,采用第二代高通量测序技术(简化的代表性亚硫酸氢盐测序,RRBS)检测其小鼠海马组织基因组DNA,然后将测序后的结果过滤并用Bismark(v O.7.4)软件进行比对分析以获取异常甲基化基因。结果二代高通量测序法筛选出的Ptprd基因在中期阿尔兹海默病程中呈低甲基化改变(P<0.05)。结论在中期AD d KO小鼠模型中可能出现了Ptprd基因低甲基化,低甲基化Ptprd基因可能与AD的中期病程有关。

中期PS1/PS2双基因敲除小鼠模型海马组织中Hnf4a基因甲基化改变

目的初步分析中期Presenilin-1/Presenilin-2双基因敲除的阿尔茨海默病小鼠模型(PS1/PS2 dKO mice)海马组织中Hnf4a基因甲基化变化。方法应用简化表观亚硫酸氢盐测序技术(RRBS)检测分析3只12月龄雌性PS1/PS2 dKO mice海马组织基因组DNA甲基化状态的改变,3只12月龄雌性同系野生型小鼠作为对照,利用相应生物软件分析结果,获得异常甲基化状态的基因。结果 RRBS甲基化测序结果显示中期阿尔茨海默病PS1/PS2 dKO mice模型海马组织中Hnf4a基因呈现高甲基化状态(P<0.05)。结论 Hnf4a基因在中期阿尔茨海默病小鼠模型中的高甲基化状态提示该基因的高甲基化可能参与到了阿尔茨海默病的病程当中。

中期阿尔茨海默病小鼠模型海马组织Mst1r基因甲基化初探

目的探讨Mst1r基因在中期病程阿尔茨海默病模型(presenilins条件性双基因敲除小鼠,d KO mice)中海马组织的甲基化状态。方法选取12月龄雌性d KO mice及同系野生型小鼠各3只,采用二代测序技术(简化表观亚硫氢酸盐测序技术,RRBS)检测其海马组织基因组DNA以获得甲基化异常基因。结果RRBS测序成果显示中期AD d KO mice海马组织中Mst1r基因呈超甲基化状态(P<0.05)。结论超甲基化的Mst1r基因可能在中期AD d KO mice的病理过程中发挥着一定作用。