双重式PCR检测鼠疫流行现场动物脏器的结果分析

目的 探讨双重式聚合酶链反应 (Pla -FI-PCR)技术在鼠疫流行现场检测动物脏器的应用。方法 应用双重式PCR技术 ,采用简单的加热法处理模板 ,对罗平县的 5 0份动物脏器进行检测。结果 检出阳性 2 2份 ,阳性率为44 %,其中活鼠脏器阳性 11份。

烟草RAPD双引物与单引物PCR扩增多态性效率的比较分析

以两个亲缘关系较远的烟草(Nicotiana tabacum)品种台烟7号和白肋21为材料(GS=0.58),研究了单引物扩增和双引物聚合扩增对RAPD-PCR分子标记多态性的影响。结果显示:双引物反应能够比单引物反应扩增出更多的多态性片段,双引物在白肋21和台烟7号中扩增出的多态性片段总数是单引物反应扩增出的多态性片段总数的6.6倍。因此,双引物RAPD的运用有助于提高烟草多态性分子标记的有效性。

在长期保存的DNA模板中用双重式PCR检测鼠疫特异性基因的结果分析

目的了解鼠、蚤材料DNA模板长期保存后鼠疫菌特异性基因的检出率。方法应用双重式PCR技术,以鼠疫菌特异性基因Pla和Fra作为引物,进行PCR实验,比较DNA模板在-20℃冰箱保存3d和5年的检测情况。结果实验感染的动物脏器模板,检出阳性率从100%降到25.00%,印鼠客蚤和缓慢细蚤的模板检出阳性率分别从100%降为16.22%和23.33%;现场采集的22份动物脏器模板阳性率从100%降为22.73%;纯菌模板对照阳性率100%。结论鼠疫PCR阳性检出率与模板中的鼠疫菌含菌量及模板保存的时间有关。

粘虫核型多角体病毒919bp片段的PCR双链直接序列测定

本文发展了ＰＣＲ克隆和亚克隆技术制备ＤＮＡ测序模板。首先，我们用ｐＵＣ／Ｍ１３系列质粒的通用正反向引物ＰＣＲ扩增出质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＤＮＡ的多克隆位点及其侧翼序列，用ＥｃｏＲＶ和ＸｈｏＩ消化成为左右两个引物多克隆臂，与粘虫核型多角体病毒（ＬｓＮＰＶ）的ＥｃｏＲＶ和ＸｈｏＩ约４００ｂｐ和５００ｂｐ片段分别连接，经ＰＣＲ扩增，得到两端具有上述正反向引物结合位点的测序模板，用ｄｄＮＴＰ链终止法／ＰＣＲ扩增／银染色，从片段两端测定了全部９１９ｂｐ序列，这种ｄｄＮＴＰ／ＰＣＲ／银染测序法简化了操作，大大缩短了测序模板的制备时间，易于实现自动化操作。

双引物PCR检测抗草甘膦豆粕饲料中的转基因成分

在一个PCR反应体系内,同步扩增大豆内参照基因lec和抗草甘膦大豆外源基因盒中的CaMV35s启动子、nos终止子或cp4 epsps基因,建立转基因大豆双引物PCR检测方法。PCR产物用限制性内切酶酶切进一步鉴定。结果表明,用双引物PCR扩增出标准转基因大豆阳性对照、阿根廷大豆、美国RR大豆及豆粕中的lec基因和相应的特异性外源基因;酶切反应确证PCR产物为特定片段大小的目的序列。建立的双引物PCR法适用于抗草甘膦大豆原料和豆粕饲料中转基因成分的简单化、高精度和高灵敏检测。

用双重式PCR检测缓慢细蚤体鼠疫菌

目的 :探讨双重式PCR在检测缓慢细蚤带鼠疫菌的应用。方法 :应用双重式聚合酶链反应 (Pla-FI-PCR)技术 ,对感染鼠疫菌的30匹缓慢细蚤进行检验。结果 :阳性29匹 ,阳性率为96 67 %。结论 :双重式聚合酶链反应适用于缓慢细蚤染带鼠疫菌的检测。

兔肠致病性大肠杆菌和魏氏梭菌毒力基因的快速检测

以一中型肉兔场为研究对象,采集病、死兔肠内容物,粪便样品,饮水,污水,饲料和以兔舍为中心不同距离处的尘土样品,共得到样品135份,运用双重PCR法同时检测样品中的肠致病性大肠杆菌(eaeA基因+)和魏氏梭菌(α-毒素基因+)。结果表明在病、死兔肠内容物中、粪便、生活污水中这两种菌同时存在和仅一种菌单独存在的几率都较大;兔舍周围尘土由近到远肠致病性大肠杆菌(eaeA基因+)存在的几率呈递减趋势,魏氏梭菌(α-毒素基因+)在兔舍周围尘土中存在的几率较少,且变化不大。

双重式聚合酶链反应检测印鼠客蚤鼠疫菌的观察

为建立蚤类感染鼠疫的快速诊断方法 ,应用双重式聚合酶链反应 (PL- FI- PCR)技术 ,对感染鼠疫菌的 4 0只印鼠客蚤进行检验 ,同时单体拉胃培养作比较。结果显示细菌培养阳性 2 2只 ,双重式聚合酶链反应阳性 4 0只 ,阳性率后者明显高于前者 ,且特异性扩增带比较清晰、典型、稳定。

双引物一条探针的实时荧光RT-PCR检测葡萄卷叶病毒3

葡萄卷叶病毒3(GLRaV-3)被认为是葡萄卷叶病最重要的致病因子。本研究根据NCBI核酸数据库中葡萄卷叶病毒3复制酶基因序列保守区,设计合成2对上下游引物和1条Taq Man探针,组成2套反应组合。以病毒RNA反转录合成的c DNA为模板,依据2组引物序列和相同的Taq Man探针序列,在荧光PCR特异性、灵敏度、扩增效率对比试验的基础上,建立了双引物一条探针的实时荧光RT-PCR检测GLRaV-3的新方法,病毒RNA检测下限可达4.5 fg/μL。两套组合相互验证,减少非特异性扩增,进一步提高了方法的特异性。

太平洋褶柔鱼及南海鸢乌贼双位点特异性PCR鉴定方法的建立

目的:市场上利用南海鸢乌贼冒充太平洋褶柔鱼作为鱿鱼加工原料的现象时有发生,拟为2种鱿鱼建立一种简单高效的DNA分子鉴定方法。方法:利用从线粒体细胞色素氧化酶亚基I(COI)发掘的太平洋褶柔鱼和南海鸢乌贼的SNP位点,分别设计2种鱿鱼的双位点特异性引物,利用多重PCR对太平洋褶柔鱼和南海鸢乌贼进行鉴定和区分。结果:双位点特异性引物在相对温和的退火温度下对2种鱿鱼品种显示了绝对的特异性,太平洋褶柔鱼和南海鸢乌贼分别扩增出了193bp和530 bp的品种特异性条带。建立的多重PCR体系可以有效地对太平洋褶柔鱼和南海鸢乌贼及两者的混合品进行鉴定。结论:多重PCR方法为市场上太平洋褶柔鱼和南海鸢乌贼的鉴定提供了有效的DNA分子手段,并可为太平洋褶柔鱼及其加工产品的原料来源检测提供客观依据。