人C-反应蛋白磁微粒化学发光酶免疫测定法的建立

人C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是炎症以及各种相关疾病如病毒感染、心血管疾病等诊断、治疗和预后的临床检测指标。为了建立一种快速、准确的CRP定量免疫测定方法,将表达纯化的重组CRP作为抗原免疫小鼠,获得了5株稳定分泌抗体的单克隆抗体细胞株,采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)初步鉴定筛选的抗人CRP单克隆抗体,并分别选择mAb 9D6和mAb 9G4作为捕获抗体与检测抗体,建立用于人CRP检测的化学发光酶免疫测定法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA),最后通过测定分析临床血清CRP样本,评价CLEIA的性能。结果显示,基于9D6/9G4-AP单克隆抗体对的CLEIA测定范围为0.1767~500μg/L(可扩展至100 mg/L);所建立的CLEIA与医院采用的免疫散射比浊法(R^(2):0.9496,P<0.0001)表现出良好的相关性,且Bland-Altman分析中96.36%(106/110)的点在95%一致性界限范围内显示两种检测方法具有较好的一致性。结果初步表明,建立的分析方法在临床诊断中具有较好的应用前景。

化学发光免疫法测定胰岛素的研究

作者以ABEI标记抗体,用双抗夹心法测定胰岛素含量,其固相化学发光采用 ABEI-CoCl_2-H_O_2体系,线性范围为每管0.3～150μU胰岛素,双对数回归方程的相关系数为0.985,绝对检测限为每管0.32μU胰岛素。

中山市A组轮状病毒感染的流行病学特征

目的 了解中山地区A组轮状病毒感染情况和流行病学特征.方法 应用免疫层析双抗体夹心法对疑似A组轮状病毒感染的患儿新鲜粪便标本进行A组轮状病毒检测,并进行流行病学分析.结果 969例标本中168例A组轮状病毒抗原检测阳性,总阳性率为,17.34%,男女比例为2.23：1.00.6～12个月年龄段婴幼儿最为易感.在该地区秋冬季节是A组轮状病毒感染的高发季节,高峰在11～12月.结论 A组轮状病毒是中山地区婴幼儿腹泻的重要病原体,对A组轮状病毒进行监测对其诊断和合理治疗及流行情况的监控具有重大意义.

人β-hCG化学发光免疫分析方法的建立

目的建立一种检测人血清hCG浓度的双抗体夹心化学发光免疫分析方法。方法采用2种高特异性的抗β-hCC单克隆抗体，以一种包被微孔板制成固相抗体，另一种标记碱性磷酸酶，以金刚烷衍生物为底物，采用双抗体夹心法检测人血清hCG浓度，并与进口试剂进行比较。结果以5μg／ml单克隆抗体包被微孔板，酶结合物以1：10000稀释，在室温条件下检测，可测范围为5—540mIU／ml，灵敏度为0．143mIU／ml，批内、批间平均变异系数分别为5．28％和7．05％，平均回收率为98．77％，范围为92．3％．108．6％，与TSH、FSH和LH的交叉反应率均小于0．01％。与国外同类试剂有良好的相关性。结论该方法有较高的灵敏度、精密性和准确性。

应用液相芯片检测空肠弯曲菌

[目的 ]建立空肠弯曲菌液相芯片检测方法。[方法 ]本研究将空肠弯曲菌HIP蛋白单克隆抗体与聚苯乙烯微球偶联,结合双抗体夹心技术建立空肠弯曲菌液相芯片检测方法,测定不同浓度的抗体与微球偶联率。通过L9(34)正交设计试验优化方法的反应条件,并进行灵敏度和特异性试验。[结果 ]较优实验条件即多克隆抗体工作浓度为1:100、生物素标记的羊抗兔IgG工作浓度为1:500、SA-PE的工作浓度为10ug/mL、生物素标记的抗体与SA-PE反应时间为90min。该方法灵敏度可达103CFU/mL,与其他常见食源性致病菌无交叉反应。[结论 ]该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可快速检测食品中的空肠弯曲菌。

不同年龄段健康儿童血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)临床评估

目的比较不同年龄段健康儿童血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性和质量差异,并对其临床合理应用进行探讨。方法选取184例健康儿童,按年龄阶段进行分组,同时选取30例健康成人设为对照组,分别采用酶免疫抑制法测定血清CK-MB活性,双抗体夹心法测定血清CK-MB质量。结果各健康儿童组和成人组CK-MB活性和质量呈明显正相关;儿童组CK-MB活性和质量随年龄增长呈下降趋势,趋近成人水平;各组质量检测均在正常参考范围,而低年龄儿童组CK-MB活性略高于临床正常值。结论临床医生在参考CK-MB活性和质量检测结果进行病情判断时,要考虑年龄因素;在临床诊断中CK-MB质量测定更优于活性测定。

电化学免疫传感器检测人附睾蛋白4的新方法

目的建立一种基于石墨烯和纳米金粒子自组装纳米复合物检测卵巢癌患者血清人附睾蛋白4(HE4)的电化学免疫检测新方法。方法将石墨烯和纳米金粒子复合物组装在丝网印刷电极(SPE)表面,利用纳米金粒子比表面积大和石墨烯电子传导速率快等特点,将大量的HE4一抗吸附在纳米金表面,继而结合大量抗原。根据双抗体夹心法原理,大量的辣根过氧化物酶标记的抗体也与抗原结合,利用辣根过氧化物酶催化过氧化氢(H2O2)产生的电流信号测定HE4水平。结果新建传感器检测HE4的范围是0~400 pmol/L,检出限(LOD)是0.5 pmol/L。结论所建方法可用于早期评估受检者患卵巢癌的风险,是临床早期诊断卵巢癌快速、简便的新方法。

促甲状腺素酶联免疫吸附试验在新生儿疾病筛查中的应用

目的:探讨新生儿疾病筛查中促甲状腺素(TSH)酶联免疫吸附试验操作实验的影响因素,有效控制实验结果的准确度,避免假阳性结果的出现。方法:对每次实验结果进行认真分析,总结其实验结果的影响因素。结果:通过进行TSH酶联免疫吸附试验操作实验,有效提高了实验结果的准确性,减少了实验结果的假阳性和召回率,节约了人力和物力。结论:在实际TSH酶联免疫吸附试验操作实验中的经验总结简明、实用,能有效地控制好实验的精确度,提高实验结果的准确度,适宜推广。

血清cPSA、tPSA及C/TPSA比值在前列腺癌诊断中的应用

目的探讨血清复合态的PSA(complexed PSA,cPSA)、血清总PSA(total PSA,tPSA)及cPSA/tPSA(C/TPSA)比值对前列腺癌(prostatic cancer,PCa)与良性前列腺增生(benign prostatic hypertrophy,BPH)的鉴别诊断价值。方法对30例PCa(PCa组)患者和50例BPH(BPH组)患者采用Bayer公司的双抗体夹心磁微粒化学发光免疫法检测cPSA、tPSA的水平,并计算C/T PSA比值。应用ROC曲线图分析C/T PSA比值对PCa的诊断意义。结果 BPH组患者C/T PSA比值及血清cPSA、tPSA水平均显著低于PCa组(均P<0.01)。以0.82筛选界值时,敏感性为83.3%(25/30)。结论 cPSA、C/T PSA比值对PCa和BPH有重要的鉴别诊断价值。

脑脊液降钙素原和乳酸联合检测对术后颅内感染的意义

目的:探讨脑脊液降钙素原(PCT)和乳酸(LA)联合检测在术后颅内感染患者中的表达及意义。方法:选择2017年5月至2020年3月术后颅内感染患者72例作为观察组,根据格拉斯哥昏迷评分(GCS)分为轻度组、中度组和重度组;选择同期治疗的开颅手术未感染患者59例作为对照组。采用速率法测定各组LA水平,采用双抗体夹心法及全自动荧光免疫法测定各组PCT水平。绘制ROC曲线,分析PCT、LA在术后颅内感染患者中的诊断效能。结果:观察组颅内感染患者PCT及LA水平均高于对照组未感染患者(P<0.05);观察组72例患者中轻度组32例,中度组27例,重度组13例。轻度组PCT及LA水平低于中度组和重度组(P<0.05);中度组PCT及LA水平低于重度组(P<0.05);ROC曲线结果表明,PCT、LA在术后颅内感染患者中诊断灵敏度均高于单一PCT、LA(P<0.05);特异度低于单一PCT、LA(P<0.05)。结论:PCT、LA在术后颅内感染患者呈高表达,二者联合检测能获得较高的诊断灵敏度,可指导临床诊疗,值得推广应用。

一种新型多元均相时间分辨荧光免疫分析方法的建立

制备出具有光学特异性的3种不同颜色量子点纳米微球和铽螯合物,分别与CEA、AFP和HBsAg的两株抗体偶联,采用双抗体夹心法模式,充分利用两株抗体与抗原的相互作用,通过采集不同量子点发出的荧光信号,根据其信号的强弱判定标记在量子点纳米微球上的抗体结合的抗原的量,从而实现多元待分析物的定性定量分析.结果表明,量子点的荧光信号与CEA、AFP和HBsAg抗原浓度呈线性关系,其函数分别为:lgY=2.791 73+0.915 84lgX(R=0.998 08)、lgY=3.695 43+0.456 44lgX(R=0.998 48)和lgY=4.128 98+0.409 45lgX(R=0.998 45),分析灵敏度分别为:0.44、0.24和0.02ng/mL.

非洲猪瘟病毒抗体时间分辨免疫荧光方法的建立及初步应用

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的时间分辨荧光免疫法(TRFIA),本研究将原核表达的ASFV重组P54蛋白(rP54)包被酶联板,并将Eu^(3+)标记rP54蛋白,经各反应条件的优化建立了双抗原夹心TRFIA。并确定该方法的cut-off值,绘制其标准曲线。结果显示,rP54最佳包被浓度为4μg/mL,100μL/孔;用150μL Eu^(3+)标记试剂标记1 mg抗原;反应体系为30μL标准品(即不同浓度的ASFV P54蛋白MAb)或待测样品+200μL/孔Eu^(3+)标记抗原+200μL/孔增强液。利用该方法检测100份健康猪血清样品得出该方法的cut off值为2.52 ng/mL。建立的标准曲线结果显示,ASFV P54抗体的线性范围为0.1 ng/mL~1000 ng/mL,R^(2)=0.9930,表明该检测方法具有良好的剂量-反应效应。通过特异性、敏感性、重复性、稳定性试验评估了该方法的检测性能。将23份疑似ASF患病猪和20份健康猪口鼻咽拭子/血清样品同时采用本TRFIA、PCR法及ELISA方法检测,分别计算配对卡方检验(McNemar test)P值和一致性检验(Kappa test)的Kappa值,分析它们之间的一致性。采用该方法检测P54 MAb标准品与其他常见猪病毒阳性血清,结果显示除了P54 MAb标准品检测为阳性结果外,其余均为阴性结果,无明显交叉反应,特异性较强;通过标准曲线方程得出该方法对ASFV P54抗体的检测下限为0.067 ng/mL,敏感性较高;重复性试验结果显示,该方法批内变异系数小于10%,回收率在95.80%~105.62%;批间变异系数小于15%,回收率在92.50%~108.97%。组装的TRFIA试剂盒在37℃可以稳定保存7 d。对23份疑似ASF患病猪和20份健康猪口鼻咽拭子/血清样品检测,结果显示,TRFIA和PCR法同时检测出4份ASFV阳性样品,其余均为阴性样品,该方法与常规PCR法检测结果的McNemar test P值为1.00,Kappa值为1.00,提示TRFIA法与PCR法检测结果的一致性较高(符合率100%),准确性高于ELISA法。本研究首次建立了基于ASFV P54抗体的双抗原夹心TRFIA,且其具有定量、准确、特异性强、敏感性高等优点,为ASF的快速、精准检测提供新的技术手段。

基于上转发光和量子点免疫层析技术的牛免疫球蛋白G检测方法的研究与评价

为了建立一种快速检测牛免疫球蛋白G(IgG)的方法,试验从牛血清中提取和纯化IgG,用微量紫外分光光度计检测浓度,并每2周1次、分4次用牛IgG分别免疫2只大耳白兔制备兔抗牛IgG多克隆抗体,用酶联免疫吸附试验检测抗体效价。分别以上转发光颗粒(UPT)和量子点(QD)作为生物示踪物,结合双抗体夹心法和双抗原竞争法原理制备4种试纸条,分别为UPT-LF-夹心法、UPTLF-竞争法、QD-LF-夹心法和QD-LF-竞争法试剂条;4种试纸条层析膜质控带均为2 mg/mL羊抗兔抗体,夹心法和竞争法检测带分别为3 mg/mL兔抗牛IgG多克隆抗体和2 mg/mL牛IgG;配制0,0.1,0.3,0.5,0.7,1,3,5,7,10,30,50,70,100μg/mL浓度的牛IgG标准品,分别用4种试纸条进行检测,对试纸条的检出限、线性和精密性进行研究,筛选最优试纸条。用筛选到的最优试纸条和折光仪同时检测52份乳样中牛IgG含量,并抽取7份乳样用液相色谱进行检测。结果表明:提取的牛IgG浓度为67.6 mg/mL,2份血清中兔抗牛IgG多克隆抗体浓度分别为34 mg/mL和70 mg/mL,兔抗牛IgG多克隆抗体效价均为1∶102400。UPT-LF-夹心法、UPT-LF-竞争法、QD-LF-夹心法和QD-LF-竞争法试纸条的检出限分别为0.3,3.0,0.1,0.5μg/mL,线性拟合的相关系数(R2)分别为0.976,0.990,0.945,0.974,4种试纸条的精密性由大到小依次为UPT-LF-夹心法、UPT-LF-竞争法、QDLF-夹心法和QD-LF-竞争法,QD-LF-竞争法试纸条为最优的试纸条。折光仪和QD-LF-竞争法试纸条检测50份牛初乳样中牛IgG含量分别为20~80 mg/mL和50~230 mg/mL。7份乳样的QD-LF-竞争法试纸条与液相色谱检测牛IgG含量的相关性高达0.9759,而折光仪与液相色谱检测牛IgG含量的相关性仅为0.8274。说明与折光仪相比,QD-LF-竞争法试纸条检测牛IgG含量的准确性更高。

单核细胞增生李斯特菌液相芯片检测方法的建立

建立单核细胞增生李斯特菌液相芯片检测方法。本研究将单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体(mAb930)与聚苯乙烯微球偶联,结合双抗体夹心技术建立单核细胞增生李斯特菌液相芯片检测方法。测定不同浓度的抗体与微球偶联率。通过L25(56)正交设计试验优化方法的反应条件,并进行灵敏度和特异性试验。应用建立的方法及国家标准检测方法同时检测200份食品样品,比较检测结果。结果显示,较优实验条件即多抗工作浓度为1:100、生物素标记的羊抗兔IgG工作浓度为1:500、SA-PE的工作浓度为10μg/mL、生物素标记的抗体与SA-PE反应时间为30 min。该方法灵敏度可达103 CFU/mL;与其他常见食源性致病菌无交叉反应。与国家标准方法检测单核细胞增生李斯特菌的结果基本相符,液相芯片法检测各种样品的假阳性率低于0.77%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可快速检测食品中的单核细胞增生李斯特菌,能够应用于实际样品的检测。

单核细胞增生性李斯特菌化学发光免疫检测法的建立及验证

目的建立检测单核细胞增生性李斯特菌(简称单增李斯特菌)化学发光法并进行验证。方法以单增李斯特菌免疫原分别免疫BALB/c小鼠及新西兰大白兔,制备鼠源单抗和兔血清多抗,建立检测单增李斯特菌化学发光免疫法,优化兔血清多抗包被浓度及单增李斯特菌反应时间,验证方法的检测范围、灵敏度、特异性、准确性及稳定性。结果制备的单增李斯特菌兔血清多抗及鼠源单抗效价分别为1∶256 000和1∶128 000。兔血清多抗最适包被浓度为0.05 mg/mL,与单增李斯特菌最适反应时间为40 min。该方法检测单增李斯特菌浓度范围为1×10^(1)~1×10^(7)C^FU/m L,灵敏度小于10 CFU/mL;除单增李斯特菌ATCC19115外,单增李斯特菌CMCC54003、CMCC54004、英诺克李斯特菌也可检测到,金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌,沙门菌未检出;添加1×10^(4)CFU/mL单增李斯特菌的火腿肠、牛奶及冰激凌溶液中回收率分别为90.3%、101.6%和969.3%;包被好的化学发光板密闭封装37℃放置28 d后,单增李斯特菌发光值为初始包被值的75.3%。结论成功建立了检测单增李斯特菌化学发光法,该方法具有检测时间短、范围宽,特异性强等特性,为促进食品安全检测提供了参考依据。