珙桐CAC基因的克隆及其作为内参基因的评价

从珙桐(Davidia involucrata Baill.)中克隆到一个编码网格蛋白衔接蛋白复合物(Clathrin adaptor complexes,CAC)的基因,命名为DiCAC(Gen Bank登录号为KX268525)。该基因开放阅读框全长1 317 bp,编码438个氨基酸。同源序列比对与聚类分析表明,该基因与其它15种植物的CAC氨基酸序列的相似度达到94%以上,其中与葡萄CAC的氨基酸序列同源性最高。为评价该基因作为珙桐内参基因的可行性,结合5个珙桐管家基因(ACT7、EF1a、GAPDH、β-TUB、18S rRNA),采用半定量PCR和实时荧光定量PCR对DiCAC基因在珙桐不同组织以及不同发育阶段苞片中的表达稳定性进行分析,并与常见管家基因的稳定性进行比较,结果表明,该基因在珙桐不同组织以及不同发育阶段苞片中均为稳定表达,且表达稳定性优于常见管家基因,可以作为相关基因表达研究中的内参基因。首次克隆到珙桐CAC基因,并且明确了其作为内参基因的可行性,为深入研究珙桐相关基因的表达分析提供了候选内参基因资源。

植物生长调节剂对珙桐种胚离体培养的影响

珙桐处于濒危状态的主要原因是繁殖很困难,不论是种子繁殖还是营养繁殖都不易成功。为了抢救和保护我国这一特有的珍贵资源,寻求加速育苗的方法,探索了如何有效地利用植物生长调节剂来加速珙桐种子繁殖。以珙桐种胚为材料,设置细胞分裂素(6 BA)、赤霉素(GA)、生长素(IAA)3个因子各5个水平,采用二次通用旋转回归组合设计的试验方法,结果表明:(1)6 BA对种子解萌起解抑作用;(2)IAA对完成种子形态后熟有作用;(3)GA对解除种子生理后熟至关重要。

珙桐实时定量PCR内参基因的筛选及稳定性评价

实时荧光定量PCR(qPCR)技术被广泛应用于基因表达分析,选用合适的内参基因是运用该技术准确分析目标基因表达变化的前提。本研究以珙桐不同器官为材料,采用qPCR技术分析了珙桐中6个管家基因(ACT7、eIF、EF1a、GAPDH、β-TUB、18S rRNA)及2个新内参基因(CAC、TIP41),共8个候选内参基因的表达情况,并利用ge Norm、Norm Finder和BestKeeper3种软件对候选内参基因的表达稳定性进行了评价。结果表明,CAC和ACT7在珙桐营养器官与生殖器官中均表达稳定,且新内参基因CAC的表达稳定性优于ACT7;GAPDH、EF1a、18S rRNA和TIP41在珙桐营养器官与生殖器官中均表达不稳定,尤其是GAPDH和18S rRNA的表达稳定性更差;β-TUB在珙桐营养器官中表达更稳定,而eIF在珙桐生殖器官中表达更稳定。

珙桐种子败育相关基因CesA的克隆及表达分析

严重的种子败育是影响珙桐自然繁殖的重要原因之一,调控种子败育的分子机制及关键基因目前尚不清楚。根据本研究小组前期获得的珙桐种子转录组数据,筛选到22个转录本,分属14个纤维素合酶Ces A编码基因,所有转录本在败育种子中均呈现上调表达趋势。分析珙桐种子中的纤维素含量发现,正常种子在发育过程中纤维素含量持续升高,而在败育种子中纤维素含量显著高于正常种子。挑选4个在败育种子中显著上调的Ces A基因进行q PCR分析,结果表明它们表达模式相似,在败育种子中表达量均显著高于正常种子,且在正常种子发育后期上调表达。挑选其中表达差异最显著的c43681.graph_c0进行克隆获得882 bp片段。经序列比对,其编码产物包含292个氨基酸,与拟南芥纤维素合酶Ces A4同源性最高。分析c43681.graph_c0在珙桐不同组织中的表达量发现,该基因在茎中表达量较低,而在果肉中表达量较高,在败育种子中表达量显著高于其它组织。本研究筛选到的c43681.graph_c0可能是一个在珙桐生殖器官中调控纤维素合成的关键基因。

珙桐MYB转录因子DiMYB1基因的克隆及表达分析

根据珙桐转录组测序结果,筛选到一个与原花青素合成相关的基因,通过克隆该基因片段并进行序列分析确定该基因编码一个珙桐MYB转录因子,将其命名为DiMYB1(GenBank登录号KR996175)。该基因开放阅读框全长为924 bp,编码产物包含307个氨基酸。对其编码产物的基本理化性质、亲水性和疏水性、保守结构域、亚细胞定位等方面进行了生物信息学分析和预测。对DiMYB1基因编码产物的氨基酸序列进行聚类分析表明,其与拟南芥MYB123转录因子的同源性最高。应用qRT-PCR分析该基因的表达模式发现,DiMYB1基因在珙桐紫色幼叶中的表达量最高,其次是雄蕊,在芽、茎、成熟叶片、苞片、果肉和种子中只有微量表达。另外,DiMYB1基因的表达量在珙桐败育种子中显著高于正常种子,且在中期败育种子中表达量达到最高。构建原核表达载体pET-28a(+)-DiMYB1,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达。本研究通过对DiMYB1基因进行克隆与表达分析,为探索该基因在珙桐逆境胁迫、花青素合成和种子发育过程中的调控功能奠定基础。