穿心莲内酯对金黄色葡萄球菌外排系统的抑制作用

为探究穿心莲内酯(AP)对金黄色葡萄球菌(S.aureus)外排系统的抑制作用,本试验采用微量肉汤稀释法和棋盘法检测AP与抗菌药物的联合抑菌作用,荧光分光光度法检测AP对S.aureus体内环丙沙星蓄积量的影响,PCR和实时荧光定量PCR方法检测S.aureus外排泵基因的携带情况和AP对S.aureus外排泵基因转录水平的影响。结果显示,AP与环丙沙星具有协同作用;AP与S.aureus作用12 min时,能极显著提高菌体内环丙沙星的蓄积量(P<0.000 1);外排泵基因norA、norB、norC、sepA、mepA和mdeA同时携带的比例为24.1%,norB基因的检出率最高,为87.4%;AP作用后,S.aureus外排泵基因转录水平均极显著下降(P<0.001或P<0.000 1),其中norB在AP浓度达到256和512μg/mL时下降幅度最大,较空白对照降低91%(P<0.001),提示AP可通过抑制外排泵基因的表达来增强S.aureus对药物的敏感性。本试验从耐药表型和基因表达水平来确认AP是否可成为一种潜在的外排泵抑制剂,为解决S.aureus耐药问题提供新的思路。

鲍氏不动杆菌耐喹诺酮类药物的机理研究

目的 研究鲍氏不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制。方法 对临床上收集的耐环丙沙星鲍氏不动杆菌进行氟罗沙星摄取试验、外膜蛋白电泳、PCR扩增 gyrA和parC基因、酶切分析和测序。结果 耐药株药物聚积量不及敏感株的 1/2 ,经碳酰氰间氯苯腙 (CCCP)处理后 ,聚积量上升并接近敏感株 ;经SDS PAGE电泳 ,耐药株与敏感株比较 ,外膜蛋白在约 2 9ku条带处消失 ,而 2 4ku处条带却明显增强 ;PCR RFLP分析 ,gyrA基因能产生 1条DNA片段 ,而 parC基因则能产生 2条片段 ;测序结果显示 ,其GyrA蛋白中所编码 83位 (相应于大肠埃希氏菌 )氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸 ,ParC蛋白未见氨基酸改变。结论 该株对环丙沙星耐药鲍氏不动杆菌存在DNA促旋酶变异 ,药物主动外运及外膜的改变。

介导对氟喹诺酮类药物耐药的金黄色葡萄球菌norA基因的研究

目的研究导致对氟喹诺酮类药物耐药的金葡菌norA基因的介导机制。方法 K-B纸片扩散法测定细菌敏感性(Kirby-Bauer法),研究两种FQNS在菌体内的蓄积量,通过Real-time PCR方法检测金黄色葡萄球菌norA基因的表达。结果两种药物在敏感菌菌体内的稳态蓄积浓度明显高于耐药菌,所有实验菌株中均检测到norA基因的存在,经RealTime PCR扩增后,检测到高度耐药菌株的norA基因表达量较敏感菌菌株平均norA基因表达量高0～8倍;中度耐药菌株的norA基因表达量较敏感菌株高5～17倍。结论推测norA基因表达增加是菌体内药物蓄积量减少的主要原因之一;部分菌株的耐药可能没有norA基因参与,即使有norA基因参与,起作用也不相同;可能有其他外排泵共同参与金葡菌的耐药。

碳青霉烯耐药非产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的药物敏感性及分子特征分析

目的分析碳青霉烯耐药非产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae without producing carbapenemase,CRKPPC)的抗菌药物敏感性、β-内酰胺酶基因和外排泵基因的分布及外排泵抑制剂的抑制作用。方法收集2012—2014年我院碳青霉烯不敏感肺炎克雷伯菌108株,用Mastdiscs combi Carba plus纸片系统检测碳青霉烯酶表型。用微量肉汤稀释法测定CRKPPC菌株对抗菌药物的敏感性;用PCR和DNA测序技术检测β-内酰胺酶耐药基因,包括超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamase,ESBL)和质粒介导的头孢菌素酶(Amp C)编码基因及外排泵基因acr AB-tolC、kex D、kde A、kpn EF和kpn GH;外排泵抑制剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)和利血平抑制试验分析外排泵在碳青霉烯耐药中的作用;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析细菌外膜孔蛋白Omp K35和Omp K36的表达。结果碳青霉烯不敏感肺炎克雷伯菌菌株中有26株细菌为CRKPPC;这26株细菌对β-内酰胺类药物高度耐药,对阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星和环丙沙星的耐药率均较高,但对替加环素、多黏菌素、头孢他啶/阿维巴坦和氨曲南/阿维巴坦等有很好的敏感性; blaCTX-M和blaSHV检出率依次为76.9%和57.7%;外膜孔蛋白Omp K35和Omp K36均有不同程度的缺失,缺失率分别为57.7%和19.2%;80%以上的细菌中存在acr AB-tolC、kex D、kde A、kpn EF和kpn GH基因; CCCP对碳青霉烯类药物具有显著的抑制作用,而利血平没有明显的抑制作用。结论替加环素、多黏菌素可以作为CRKPPC联合用药的基础药物。CRKPPC菌株中存在Amp C、ESBLs及不同程度的外膜孔蛋白Omp K35和Omp K36缺失,但外排泵对碳青霉烯类药物的外排作用是CRKPPC对碳青霉烯耐药的主要机制,外排泵抑制剂可能在这种细菌引起的感染治疗中有重要价值。

志贺菌主动外排泵acrAB-tolC及调控基因marOR突变与耐药的关系

目的:研究志贺菌的耐药状况,检测临床分离志贺菌主动外排泵acrAB-tolC基因及调控基因marOR的突变情况,并探讨其与耐药性的关系。方法:对159株临床分离的志贺菌进行四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、诺氟沙星、复方新诺明6种药物的药敏试验和有机溶剂耐受试验,对其acrAB-tolC基因和marOR基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增,并进行限制性内切酶酶切与单链构象多态性(SSCP)分析。结果:159株临床分离的志贺菌属细菌筛选出4株敏感株、18株耐单药株和137株耐多药株,耐多药率为86.2%(137/159);159株中有122株对有机溶剂耐受,耐受率为76.7%(122/159);159株均扩增出acrAB-tolC基因和marOR基因,未发现基因缺失株;单链构象多态性分析,155株耐药菌株中,marOR基因的突变率为17.4%,acrA基因的突变率为5.8%,acrB基因的突变率为3.9%,tolC基因的突变率为2.6%;4株敏感株未发现marOR、acrA、acrB和tolC基因突变。结论:临床分离的志贺菌耐多药率和有机溶剂耐受率均较高,且存在较高的marOR基因突变率。

多重耐药鲍曼不动杆菌临床分布及外排泵基因的检测

目的了解多重耐药鲍曼不动杆菌临床分布并检测其外排泵基因型。方法统计96株多重耐药鲍曼不动杆菌临床分布,用Kirby-Bauer法检测96株多重耐药鲍曼不动杆菌对15种抗菌药物的耐药情况,并用PCR扩增进行外排泵基因的检测。结果 96株多重耐药鲍曼不动杆菌主要分布在重症监护病房(54.2%)和呼吸内科(18.8%);对喹诺酮类、头孢菌素类、氨基糖苷类、四环素类抗菌药物的耐药率均在70%以上;分布在重症监护病房的52株多重耐药鲍曼不动杆菌中检测到ade B、ade R、ade S、ade J、ade E、abe M基因分别有18株(34.62%)、16株(30.77%)、18株(34.62%)、18株(34.62%)、0株、18株(34.62%);分布在呼吸内科的18株多重耐药鲍曼不动杆菌中检测到ade B、ade R、ade S、ade J、ade E、abe M基因分别有9株、8株、8株、8株、0株、8株。结论外排泵基因是分布在重症监护病房和呼吸内科的鲍曼不动杆菌发生多重耐药的重要因素。

多药耐药鲍曼不动杆菌抗菌剂外排泵基因研究

目的了解多药耐药鲍曼不动杆菌(MDR-ABA)抗菌剂外排泵基因存在状况与细菌耐药关系。方法采用PCR方法检测4种抗菌剂外排泵基因(adeB、mdfA、qacE△1、tehA),PCR阳性产物采用PCR直接全自动荧光法测序。结果 20株MDR-ABA有18株检出同时携带adeB、mdfA、qacE△1基因,阳性率为95%,且tehA均为阴性。结论连续分离的多药耐药鲍曼不动杆菌抗菌制剂外排泵基因检出率较高可能是MDR-ABA呈多重耐药的原因,其具有流行病学意义。

肺炎克雷伯菌外排泵基因研究与耐药性的关系

目的分析肺炎克雷伯菌外排泵基因研究与耐药性的关系,为细菌耐药管理提供依据。方法选取2016年1月至2018月12月在该院住院的儿科患儿,从粪便、痰液、血液、组织液等标本中分离获得鉴定肺炎克雷伯菌144株,对其进行耐药性分析、基因分析及相关性分析。结果耐药性分析结果显示,肺炎克雷伯菌对氨苄青霉素耐药率最高,对亚胺培南、美罗培南的敏感性较高。肺炎克雷伯菌的外排泵基因检出率为0.0%~86.8%,阳性率最高为AcrAB-TolC,最低为qepA。检出外排泵基因3~6个,检出耐药药物品种1~10个,耐药药物品种数与外排泵基因存在正相关性(r=0.412,P<0.05),qacE△1-sull的耐药药物品种数高于其他类型的基因,差异有统计学意义(P<0.05)。结论肺炎克雷伯菌外排泵基因与耐药性存在相关性,外排泵类型、数量都会增加耐药风险。

泛耐药鲍曼不动杆菌新疆分离株氨基糖苷类药物耐药机制研究

目的:探讨一组分离自新疆的泛耐药鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类药物的耐药机制。方法:收集患者标本中分离的泛耐药鲍曼不动杆菌共20株,用聚合酶链反应(PCR)的方法分析5种氨基糖苷类修饰酶基因、2种16SrRNA甲基化酶基因和外排泵蛋白AdeB编码基因adeB。结果:本组20株泛耐药鲍曼不动杆菌检出aac(3)-Ⅰ、aac(6’)-Ⅰb、ant(3")-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ等4种氨基糖苷类修饰酶基因和armA 16SrRNA甲基化酶基因以及adeB外排泵基因,阳性基因共分为6种阳性模式。主要的阳性模式为(aac(3)-Ⅰ+aac(6’)-Ⅰb+ant(3")-Ⅰ+aph(3’)-Ⅰ+armA+adeB)六种基因阳性11株,占55%;(aac(3)-Ⅰ+aac(6’)-Ⅰb+ant(3")-Ⅰ+aph(3’)-Ⅰ+adeB)五种基因阳性4株,占20%;未检出ant(2")-Ⅰ及rmtB基因。结论:产修饰酶和产靶位甲基化酶以及AdeABC外排泵系统是导致本组菌株对氨基糖苷类药物耐药的主要原因。

泛耐药鲍曼不动杆菌主动外排泵adeB基因表达及耐药性研究

目的探讨细菌主动外排泵adeB基因在临床分离的泛耐药鲍曼不动杆菌耐药性中的作用。方法琼脂稀释法检测临床分离泛耐药鲍曼不动杆菌经外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)处理前后对抗生素最小抑菌浓度(MIC)变化,以聚合酶链反应(PCR)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测外排泵基因ade B及其表达水平。结果 50株泛耐药鲍曼不动杆菌临床株加入CCCP后,MIC值小于原值的1/4或1/4以下的四环素42株(84%)、氧氟沙星45株(90%)、亚胺培南45株(90%)、头孢噻肟50株(100%)、庆大霉素50株(100%)。50株泛耐药鲍曼不动杆菌临床株和4株敏感菌株均检测到ade B基因,但泛耐药株表达水平明显高于敏感株(P<0.01)。结论泛耐药鲍曼不动杆菌耐药性与外排泵adeB基因高表达密切相关。

药物流出泵基因在白假丝酵母菌生物膜耐药性产生机制中的作用

目的利用药物流出泵基因缺陷株,初步阐明药物流出泵基因CDR1、CDR2、MDR1在生物膜耐药性产生和表现型耐药菌株产生中的作用。方法以3种咪唑类抗真菌药物以及CDR1药物流出泵抑制剂作用于药物流出泵基因缺陷株形成的生物膜,采用XTT法和菌落计数的方法,分析药物流出泵基因在生物膜耐药性产生中的作用。结果药物流出泵基因对缺陷株形成的24h生物膜SMIC80影响不大,生物膜表现型耐药株的产生与药物流出泵基因有关,抗真菌药物联合CDR1基因抑制剂在一定程度上能够帮助杀灭白假丝酵母菌生物膜耐药株。结论药物流出泵基因对24h生物膜表现出来的耐药性影响不大,而对生物膜产生的耐药株有重要作用。

空肠弯曲菌耐药机制研究进展

空肠弯曲菌是一种全球关注的人兽共患病病原菌,由于滥用抗生素而造成其耐药性不断增强,成为公共卫生日益关注的问题。各类抗生素作用位点的基因突变是诱发空肠弯曲菌对各类临床常用的抗生素产生耐药的主要原因,同时细菌对药物的外排机制也在其对抗生素耐药过程中发挥了一定的作用。文章对空肠弯曲菌对各类临床常用抗生素的耐药机制做一综述。

主动外排系统acrAB在临床分离大肠杆菌中的分布和表达

为了研究临床分离多重耐药大肠杆菌的耐药机制，我们采用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测大肠杆菌主动外排系统ＡｃｒＡＢ结构基因ａｃｒＡＢ在临床分离菌株中的分布并用ＲＴ－ＰＣＲ测定其ｍＲＮＡ表达水平。结果在所有的临床分离大肠杆菌染色体中均发现有ａｃｒＡＢ基因，未发现ａｃｒＡＢ缺失株；大肠杆菌多重耐药株ａｃｒＡＢ的ｍＲＮＡ水平明显高于敏感野生株和其它耐药谱不同的菌株，而敏感野生株和耐药谱不同的菌株间无差别。本研究表明大肠杆菌ａｃｒＡＢ表达水平决定了大肠杆菌多重耐药表型，ｍａｒ可能调控ａｃｒＡＢ的表达。

多药耐药大肠埃希菌老年患者分离株抗菌制剂11种外排泵基因研究

目的了解多药耐药大肠埃希菌中外排泵基因的存在情况。方法微量稀释法检测耐药菌株的药敏结果,采用聚合酶链反应(PCR)扩增法,检测11种抗菌制剂外排泵基因:emrB、emrD、emrE、mdfA、sugE、mdtI、tehA、oqxA、qacE△1、qacEs、mr-2等11种抗菌制剂外排泵基因,扩增产物纯化后基因测序。结果大肠埃希菌对阿米卡星耐药率为60%,对复方新诺明耐药率为95%,对第三代头孢菌素耐药率为100%(均为产ESBLs菌株),外排泵基因检出率分别为emrB 95.0%、emrD 75.0%e、mrE 50.0%、mdfA 80.0%、sugE 70.0%、mdtI 80.0%、qacE△1 80.0%、tehA 80.0%、oqxA 15.0%,qacE、smr-2基因均未检测到,最少者检出1种基因,最多1株检出9种基因。结论本组分离的大肠埃希菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类、氯霉素等抗菌药物呈多重耐药,可能与细菌携带多种抗菌制剂(包括灭菌剂、消毒剂、抗菌药物等)外排泵基因相关。

烧伤临床鲍曼不动杆菌生物膜形成对外排泵调节基因adeS和adeR及其功能基因簇adeAB表达的影响

目的了解烧伤临床鲍曼不动杆菌分离株在游离、生物膜成膜状态下,其外排泵上游调节基因ade S和adeR的表达变化以及相应功能基因簇ade AB的改变,探讨生物膜形成对细菌主动外排功能和耐药的影响。方法选取2013年3—9月上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤住院患者创面、血液和静脉导管来源的鲍曼不动杆菌耐药菌9株、敏感菌9株,试管摇菌法培养24 h后采用实时荧光定量PCR技术分别检测外排泵基因ade A、ade B以及调节基因ade S、adeR的mRNA相对表达量。结果耐药株和敏感株在游离态(游离菌)下ade A、ade B、ade S、adeR的表达量均高于各自成膜后(膜内菌)的表达量(均P<0.05)。耐药株在游离态(游离菌)和成膜后(膜内菌)ade A、ade B的表达量均高于敏感株(均P<0.05)。结论主动外排作用是游离态鲍曼不动杆菌耐药的主要机制之一。生物膜形成后,鲍曼不动杆菌膜内菌通过ade S感应膜内环境变化后下调其自身表达,继而钝化adeR,减少功能基因ade AB的表达,使得生物膜成为细菌耐药的主要原因。

大肠埃希菌尿潴留患者尿液分离株同时检出六种抗菌制剂外排泵基因

目的调查7种抗菌制剂外排泵基因(smr-2、emrB、emrD、emrE、mdfA、tehA、qacE△1)在一株大肠埃希菌尿潴留患者尿液分离株(ECO-024)中的存在情况。方法大肠埃希菌ECO-024于2009年2月分离自宁波市第一医院一例尿潴留患者的尿液标本,采用聚合酶链反应(PCR)检测7种外排泵基因。结果ECO-024共检出6种外排泵基因:emrB、emrD、emrE、mdfA、tehA、qacE△1,只有smr-2未能检出。结论同时检测这7种抗菌制剂外排泵基因是国内首次报道。其中有6种基因在大肠埃希菌尿液分离株中被检测到,这或许是导致分离株呈多重耐药的一个重要原因。在大肠埃希菌中检出mdfA、emrB、emrD、emrE基因为国内首次报道。

临床铜绿假单胞菌多重耐药株外排泵机制研究

目的研究临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌MexA-MexB-OprM外排泵的外膜蛋白OprM的表达及泵调节基因mexR突变情况。方法筛选铜绿假单胞菌多重耐药株13株和敏感菌株5株进行外膜蛋白SDS-PAGE分析,比较OprM的表达差异。聚合酶链反应(PCR)法扩增mexR基因,鉴定产物,测序。结果多重耐药菌株组OprM蛋白在相对分子量为49 kD处的各电泳条带较敏感菌株和质控菌株铜绿假单胞菌ATCC 27853的灰度明显增强,其光密度值多重耐药菌株组为157.79,敏感菌株组为132.03,两组比较,差异有显著性(t=19.345,P<0.01);多重耐药菌株mexR基因产物测序,除个别碱基插入外,以A-96→G,G-411→A,C-308→G,T-377→A 4个核苷酸点突变为主,后二者还导致了其编码的氨基酸发生改变,分别为Ala-103→Gly,Val-126→Glu。结论OprM表达增强提示MexA-MexB-OprM外排泵耐药机制参与多重耐药形成。多重耐药菌株的mexR基因均存在点突变,提示mexR基因突变引起MexA-MexB-OprM外排泵表达增强。

大环内酯类外排基因的研究进展

大环内酯外排基因(mef)是目前大环内酯类抗生素耐药机制的研究热点之一。目前检测到的mef基因出现在M型耐药球菌,包括mefA,mefE和mefI这3个亚型。mefA定位于转座子Tn1207.1或Tn1207.3,可以在不同球菌属间水平传递;mefE基因定位于大环内酯外排基因集合体(macrolide efflux genetic assembly,mega),亦可在球菌属间水平传递,并可整合到细菌Tn2009中;携带mefI的遗传成分长30505 bp,左端是Tn5252和Tn916,右端为15115 bp未命名的新基因,目前还未发现mefI基因具有传递性。这3个基因亚型介导的耐药具有不同特点,目前已经研发出多种mef基因的检测方法。

肠球菌GyrA基因突变和多重耐药泵与氟喹诺酮耐药性关系研究

目的探究肠球菌GyrA基因突变和多重耐药泵与氟喹诺酮类药物耐药性的关系。方法全部试验菌株使用VITEK 2-Compact仪器和GPI卡进行鉴定。通过PCR和单链构象多态性(SSCP)法检测对左氧氟沙星(Levo)与环丙沙星(Cip)耐药的30株粪肠球菌和10株屎肠球菌GyrA基因有无碱基发生突变,并通过基因测序确定其突变类型。检测了30株粪肠球菌在M-H琼脂中加入终浓度为20μg/mL利血平后Cip MIC值的改变。结果 PCR-SSCP分析结果表明40株对Levo和Cip同时耐药肠球菌均扩增出GyrA基因,其中有24株粪肠球菌和4株屎肠球菌的单链泳动带与粪肠球菌ATCC 29212和敏感菌株的单链泳动带相比较出现异常。其中粪肠球菌在第87位上有密码子改变:GAA变为GGA;屎肠球菌在第83位有密码子改变:AGT变为TAT,这些突变均可引起氨基酸的改变。在M-H琼脂中加入利血平可以提高部分粪肠球菌对环丙沙星的敏感性。结论用PCR-SSCP法检测40株肠球菌的GyrA基因并通过测序分析,显示有70%(28株)肠球菌碱基发生了突变,说明GyrA基因喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)突变是肠球菌对氟喹诺酮类药物耐药的重要原因,此外还有药物泵出等耐药机制的存在。

多耐药大肠埃希菌NB8株全基因组耐药基因检测

目的检测1株多耐药大肠埃希菌NB8株的遗传学背景。方法病原分离自2012年4月宁波市第一医院住院患者尿液,作16SrDNA和gyrA基因测序、BLASTn比对确认为大肠埃希菌,采用Illumina HiSeq与Ion Torrent PGM两种大规模并行测序仪进行全基因组分析,再行人工测序。最后NB8株和9株已完成全基因组测序的大肠埃希菌耐药基因的比较基因组学研究。结果多耐药大肠埃希菌NB8株全基因组测序得到一条推定的染色体序列,长4 550 369bp(内含14个缺口),得到一条推定的质粒序列,长635 377bp(内含33个缺口)。从NB8株全基因组数据中挖掘出了β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类、磺胺类、四环素类、多粘菌素的耐药基因,并挖掘出接合性质粒、转座子、插入序列、整合子的遗传标记,以及5大类外排泵基因。结论多耐药大肠埃希菌NB8株遗传学背景明确,主动外排机制增强也会导致或者增强NB8株的耐药性。质粒、转座子和整合子等可移动遗传元件可以使细菌的耐药性得以快速传播,使受体菌表现为多重耐药。