牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒双重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinortracheitis virus,IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的双重PCR检测方法,根据GenBank中IBRV gB(UL27)和BVDV 5’-UTR基因序列分别合成特异性引物,优化反应条件,建立了能够同时检测IBRV和BVDV的双重PCR方法,并对其特异性、敏感性、重复性进行了测试。结果显示:该方法对IBRV、BVDV和IBRV/BVDV可分别扩增出500、198、500/198 bp的特异性目标条带,对牛呼吸道合胞体病毒、牛冠状病毒、牛细小病毒、牛纽布病毒和牛支原体检测结果均为阴性;对混合液中IBRV、BVDV的最低检测限分别为10^(4)和10^(3)copies/μL;3次重复性试验结果一致。采用建立的方法对79份临床可疑牛血清样品进行IBRV、BVDV和IBRV+BVDV检测,阳性率分别为12.66%、17.72%和8.86%,与IBRV和BVDV单重PCR检测结果符合率分别为90.00%和93.33%,两种病原混合感染的阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的IBRV和BVDV双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,为兽医临床快速诊断IBRV和BVDV提供了一种方便、快捷的分子生物学检测手段。

犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCoV)的方法,本研究采用PCR方法分别扩增CDV N基因和CCoV S基因,并克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒pCDV-N、pCCoV-S,均经PCR和测序鉴定后测定浓度作为质粒标准品。同时针对CDV N基因和CCoV S基因设计特异性引物和TaqMan探针,采用方阵试验对各反应条件的优化,建立了同时检测这两种病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。利用10倍倍比稀释的质粒标准品按照该方法检测,建立标准曲线,结果显示,两个重组质粒标准品均与各自的Ct值具有良好的线性关系。采用该方法分别检测CDV、CCoV、犬细小病毒、犬传染性喉气管炎病毒2型、犬副流感病毒,评估该方法的特异性;将两种质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后,取108~101稀释度的质粒混合物作为模板,采用该方法检测,评估该方法的敏感性;将两种质粒标准品10倍倍比稀释并等体积混合后,分别取107、105、103稀释度的质粒标准品混合物采用该方法检测,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能特异性扩增CDV和CCoV,与犬的其他病毒均无交叉反应,特异性较强;对CDV质粒标准品的检测限为5.0×103拷贝/μL,对CCoV质粒标准品的检测限为4.93×103拷贝/μL,敏感性较高;组内和组间的变异系数均小于3%,重复性较好。利用本实验建立的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法和已报道的CCoV RT-PCR及国标规定的CDV RT-PCR方法同时检测采集的100份临床腹泻犬样品,结果显示,共检出35份阳性样品,其中,CDV的阳性检出率为16%(16/100),CCoV的阳性检出率为19%(19/100),阴性样品65份,与CCoV和CDV参考方法的检测结果均一致。本研究建立的CDV和CCoV双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可在40 min内完成检测,且准确、快速、敏感,为CDV和CCoV临床大量样品的快速和特异性鉴别检测提供了有效技术手段。

猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立和初步应用

本研究旨在建立一种快速、高效、灵敏的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双重鉴别荧光定量PCR检测方法,针对CSFV E2基因和BVDV 5′UTR基因序列的高度保守区域设计特异性引物和探针,经过反应条件及体系的优化,建立双重RT-qPCR方法。结果表明,该方法最低检测值均为5 copies·μL^(-1),比普通PCR灵敏约200倍,敏感性高;可准确区分CSFV和BVDV,且与口蹄疫病毒、猪伪狂犬病病毒等猪常见病原均无交叉反应,特异性强;组内和组间重复变异系数均小于2%,重复性良好。对109份临床样品及7份商品化牛血清分别采用构建的双重RT-qPCR检测方法及CSFV RT-qPCR检测方法(GB/T 27540—2011)和BVDV RT-qPCR检测方法(GB/T 18637—2018)进行检测和对比,符合率为100%,同时,检测结果还证实目前商品化牛血清中仍存在BVDV污染,为CSFV、BVDV的鉴别诊断及流行病学的调查提供了技术支持。

炭疽杆菌双毒力因子荧光PCR检测方法的建立及应用

由炭疽杆菌(Bacillus anthracis)引起的炭疽(anthrax)是严重危害人类和家畜健康的重大传染病。为了提高出入境口岸对不明粉未快件样品的查验效率,防范通过包裹夹带生化武器,本研究使用TaqMan探针技术,建立了针对炭疽杆菌两种毒力质粒pOX1和pOX2的双重荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和稳定性进行了试验。结果显示:本研究建立的炭疽杆菌双重荧光PCR检测方法具有较强的特异性,只特异性检出炭疽杆菌pOX1和pOX2,而与金黄色葡萄球菌等19种对照病原菌均无交叉反应;灵敏度与单重荧光PCR方法相近,最低检测限可达10 copies/μL;稳定性好,反应体系低温保存2、4、6、8个月后,检测阳性质粒的Ct值和峰值相差不大。应用该方法检测600份猪牛羊组织样本,均未检出炭疽杆菌阳性核酸。本研究建立的双重荧光PCR检测方法为炭疽杆菌的快速检测提供了技术支撑。

副溶血弧菌与嗜水气单胞菌双重PCR检测方法的建立

为建立一种可精准、快捷鉴别检测副溶血弧菌(VP)及嗜水气单胞菌(AH)的方法,根据GenBank公布的VP Tlh基因及AH aerA基因保守区序列,设计合成两对特异性引物,通过优化反应体系及反应程序,成功建立了一种可同时检测VP与AH的双重PCR方法,并开展了特异性及敏感性试验。结果显示:VP Tlh和AH aerA基因扩增条带大小分别为500、760 bp;反应体系中Tlh与aerA基因引物最优浓度分别为7.5、10.0 nmol/L,反应程序中最佳退火温度为56.8℃;该方法对VP、AH的最低可检出细菌浓度均为1.2×10^(3)CFU/mL;对地衣芽孢杆菌、微小杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡阳芽孢杆菌、普通变形杆菌、维氏气单胞菌、布氏柠檬酸杆菌、豚鼠气单胞菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、简氏气单胞菌等其他非目标菌均无交叉反应,仅对VP和AH呈特异性阳性扩增。综上,本研究建立了一种可快速鉴别诊断VP、AH的双重PCR检测方法,其特异性强、灵敏度高,可为VP、AH等细菌性病原引发的水生动物疫病的快速诊断、监测及有效防控提供技术支持。

BVDV与IBRV二重二温式PCR检测方法的建立及应用

针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的5′非翻译区(5′UTR)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的gB基因分别选取2对引物,建立这2种病毒的二重二温式PCR检测方法,该方法特异性高,可检出BVDV与IBRV,与牛轮状病毒等均无交叉反应;对BVDV与IBRV的最低检测质量浓度为1.32、0.047 mg/L。使用该方法对采集自宁夏地区的113份具有BVDV与IBRV临床症状的牛的粪便进行检测,结果显示BVDV与IBRV的阳性检出率分别为12.39%、22.12%,2种病原体混合感染的阳性检出率为7.08%。与单重二温式PCR检测结果进行比较,得出BVDV阳性符合率为93.33%,IBRV阳性符合率为92.53%,2种病原体混合感染的阳性符合率为100%。

禽流感病毒H7和N2亚型nano-dPCR检测方法的建立和应用

为建立一种同时检测H7亚型和N2亚型禽流感病毒(AIV)的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法,从GenBank中分别下载H7亚型AIV的HA基因序列和N2亚型AIV的NA基因序列,采用Primer 7.0和Oligo 6.0软件设计了2对特异性引物,通过对nano-dPCR反应条件进行优化确定最佳反应体系;利用优化好的反应体系开展nano-dPCR方法的特异性和敏感性试验;采集活禽市场家禽咽喉及泄殖腔拭子样品进行临床样品检测并进行验证。结果表明,成功建立了一种同时检测H7亚型(723 bp)和N2亚型(314 bp)AIV的nano-dPCR方法,该方法特异性良好,其他亚型禽流感病毒及常见禽类呼吸道病毒均未出现特异性的条带,H7亚型AIV和N2亚型AIV的最低核酸检测量分别达到了5×103、5×103拷贝/μL,其敏感性是普通双重PCR检测方法的10倍,其对临床样品检测结果准确率达到100%,可以用于禽流感临床样品鉴别诊断和日常防控监测。

恶性疟原虫和卵形疟原虫双重实时荧光PCR检测方法研究

本研究利用SN/T 4793—2017国境口岸疟原虫实时荧光PCR检测方法中恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)特异基因引物探针和自行设计的卵形疟原虫(Plasmodium ovale)特异基因引物探针,对37个疟原虫样本进行鉴定,并建立恶性疟原虫和卵形疟原虫的双重实时荧光PCR检测方法。根据恶性疟原虫和卵形疟原虫的引物探针,优化检测方法,验证其特异性、重复性和灵敏性,建立双重实时荧光PCR方法,为口岸实验室检测机构提供节省人力及试剂成本的便捷准确方法。

贝类中沙门氏菌、阪崎肠杆菌双重RT-PCR检测方法研究

旨在建立一种快速、高效、经济、实用的双重实时荧光PCR方法,能同时快速、灵敏、特异地检测贝类中沙门氏菌、阪崎肠杆菌的双重实时荧光PCR体系。本研究以水产品中贝类为目标,根据特定基因序列,设计特异性扩增引物和TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和条件,每种引物探针体系均可以特异性检测目标致病菌类型。2套引物探针体系组合可同时检测沙门氏菌、阪崎肠杆菌。双重RT-PCR方法的最低检测限可低至0.002 ng或0.02 ng基因组/反应,变异系数均小于2%。利用建立的双重RT-PCR方法检测14份贝类产品样本,样品实测结果与国家标准方法的检测结果一致,符合率为100%。结果表明,本研究建立的双重RT-PCR方法具有特异性、敏感性高、重复性好等优点,为贝类产品中沙门氏菌、阪崎肠杆菌的快速检测提供了新的技术方法。

双重抑制PCR技术分离鹅微卫星标记

用双重抑制PCR技术分离11对鹅的特异微卫星引物,应用于浙东白鹅和太湖鹅的基因组PCR扩增。结果表明:11对引物在浙东白鹅和太湖鹅中分别扩增出37和36个清晰条带,20个等位基因为两品种所共有,11对引物中有5对呈中等多态、6对呈高度多态。各位点产生2～6个等位基因,各位点的平均杂合度为0.456～0.772,以G07位点为最高,G06位点为最低;平均多态信息为0.375～0.737,以G07位点为最高,G01、G03和G11位点为最低。浙东白鹅和太湖鹅有效等位基因数分别为2.655和2.558,与实际测得的两品种平均值3.364和3.273较接近。研究结果表明,两品种的等位基因分布较为均匀,与鹅的实际品种特征一致,因此,双重抑制PCR技术适合于鹅的基因组结构研究。

甘蔗宿根矮化病菌PCR检测技术研究

以甘蔗茎组织总DNA为模板,以16S rRNA基因赖氏细菌属(L eif son ia)通用引物为第一轮引物、甘蔗宿根矮化病菌(L eif son ia xy li subsp.xy li,Lxx)亚种特异引物为第二轮引物建立了Lxx巢式PCR检测技术。根据已报道的Lxx巴西分离物基因组全序列(G enB ank登录号AE 016822.1)设计了扩增致病相关基因片段的3个引物对,经多种组合进行了RCR检验,筛选出两个特异性好、灵敏高的引物对,建立了Lxx的多重PCR检测技术。克隆测序表明,PCR产物与巴西分离物基因组相应区段同一率为99%以上,从而证实了上述PCR技术的正确性。检测结果表明,广东样品的阳性率为90%,海南样品的阳性率为60%。

沙门菌和副溶血性弧菌双重荧光PCR快速检测方法的建立

根据沙门菌invA基因和副溶血性弧菌toxR基因的保守序列设计引物和探针,通过优化反应条件与参数,建立了可同时检测沙门菌和副溶血性弧菌的双重荧光PCR方法。结果显示,该方法敏感度高,特异性强,重复性好。对沙门菌和副溶血性弧菌的检测低限均低于每反应体系10CFU,经对29株非目标菌进行检测均呈阴性,而定量检测批内和批间的变异系数均小于2%;应用该方法检测人工染菌样品和实际样品,结果与SN标准方法的检测结果一致;应用该法可在8h内完成对样品中沙门菌和副溶血性弧菌的同步检验。

利用双重抑制PCR技术分离鸭微卫星标记

用双重抑制PCR技术分离10对鸭的特异微卫星引物，应用于北京鸭、樱桃谷鸭、高邮鸭3个品种的基因组PCR扩增。结果表明：10对引物中有7对引物具有多态，3对呈高度多态，4对呈中度多态。7对引物在上述3个鸭品种中分别扩增出23、22、23个等位基因，其中15个等位基因为3个品种所共有；各位点产生4～7个等位基因，平均杂合度为0．494～0．650，平均多态信息含量为0．414～0．586，平均有效等位基因数为2．001～2．870。3个鸭品种的平均杂合度分别为0．578、0．566、0．594，平均多态信息含量分别为0．496、0．480、0．524；平均有效等位基因数分别为2．441、2．340、2．615，与实测平均等位基因数3．286、3．1z12、3．286较接近。

一种基于磁性纳米粒子PCR的高通量SNP分型方法

利用磁性纳米粒子PCR扩增(MNPs-PCR)和等位基因特异性双色荧光探针(Cy3,Cy5)杂交,建立了一种单核苷酸多态性(SNP)分型的新方法.应用该方法对9个样本MTHFR基因的C677T多态进行检测,野生和突变型样本正错配信号比大于9·0,杂合型正错配信号比接近1·0,分型结果经测序验证.此方法无须产物纯化、浓缩,扫描分型结果快速、直观,是一种操作简单、快速、高通量、高灵敏度的分型方法.

二重PCR方法鉴别气肿疽梭菌和腐败梭菌

用包含16S～23S rDNA间隔区和23S rDNA的部分序列作为气肿疽梭菌特异性标志,以α毒素部分序列作为腐败梭菌特异性标志,建立了鉴别气肿疽梭菌和腐败梭菌的二重PCR方法。结果显示:气肿疽梭菌C54-1株扩增出大小为509 bp的条带,腐败梭菌C55-1株、C55-16株均扩增出大小为148 bp的条带,均与预期吻合;而产气荚膜梭菌C57-1株、C59-37株,肉毒梭菌C62-4株,诺维梭菌C61-4株均未扩增出任何条带。扩增产物的测序结果进一步证实了本方法的特异性。菌株的生物学特性试验结果也符合相应气肿疽梭菌和腐败梭菌的特点。本研究所建立的二重PCR方法可用于气肿疽梭菌和腐败梭菌的快速鉴定。

大鼠细小病毒双重PCR检测方法的建立

目的建立快速检测大鼠细小病毒的PCR方法。方法根据大鼠细小病毒基因序列的特点,建立鉴别检测大鼠细小病毒(RPV)与其他三种大鼠细小病毒(H-1、KRV、RMV)的双重PCR方法。根据RPV核酸序列的性质,在VP2基因筛选了一对用于特异扩增RPV株的引物,在NS1基因设计了一对用于特异性扩增H-1、KRV和RMV的引物。结果两对引物组成的二重PCR方法可以特异性的扩增RPV而不扩增核酸同源性高的小鼠细小病毒和多种其他病原微生物;敏感性实验表明,二重PCR的最低检测限可达1 000拷贝/μL。双重PCR结合测序在检测23份临床样本中,检测出7份RMV阳性,包括1份与RPV共感染阳性样本。结论本研究建立的检测RPV的双重PCR方法具有特异性好、灵敏度高及操作简单等优点,是一种简便、可靠的检测方法。

双重RT-PCR同时检测兰花两种主要病毒的研究

以利用Trizol试剂盒提取的蝴蝶兰组培苗叶片总RNA为模板,根据已报道的建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglussm ringspot virus,ORSV)外壳蛋白基因(cp)的保守序列设计特异性引物,探索RT-PCR反应条件,建立了可同时检测CyMV和ORSV的双重RT-PCR体系。

豇豆花叶病毒和黑眼豇豆花叶病毒RT-Realtime PCR及IC-RT-Realtime PCR检测方法研究

建立了豇豆两种种传病毒豇豆花叶病毒(CPMV)和黑眼豇豆花叶病毒(BlCMV)RT-Realtime PCR检测方法以及双重RT-Realtime PCR检测方法。在此基础上,根据免疫学抗原抗体特异性吸附的特点,建立了CPMV和BlCMV免疫捕获反转录荧光定量(IC-RT-Realtime)PCR检测方法以及双重IC-RT-Realtime PCR检测方法。该单重及双重IC-RT-Real-time PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点,适用于豆类种苗中对CPMV和BlCMV的检测。

兰花上凤仙花坏死斑病毒和建兰花叶病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus,INSV)和建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)的保守序列设计特异性引物,建立了双重RT-PCR同时检测两种病毒的方法。用该方法对兰花基地的可疑发病兰株进行检测,结果从田间采取的12株可疑兰花中有6株检出INSV,1株检出CyMV,2株同时检出两种病毒。

猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR方法的建立

本研究根据GenBank中发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组序列,设计筛选出两对用于双重RT-PCR反应的特异性引物,通过对特异性、灵敏性和稳定性等试验,建立了检测猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒的双重RT-PCR核酸检测技术。利用建立的CSFV-PEDV双重RT-PCR核酸检测技术,对某规模化猪场病料进行检测,结果表明,扩增出大小约311 bp和501 bp大小的特异性条带,为猪瘟与猪流行性腹泻病毒混合感染。建立的CSFVPEDV双重RT-PCR核酸检测技术具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,该方法的建立为CSFV和PEDV的快速诊断、疫情监测及流行病学研究奠定了基础。