Mathematical Representation of Partial Organs Growth in Duck Embryos

In this study, the ontogeny of body and the growth pattern of heart, brain, liver, lung, gizzard, glandular stomach and spleen of duck embryos were measured from embryonic day 2 to embryonic day 26. The results indicated that the organs development trend of absolute growth and relative growth rate were almost synchrony, and both exhibited increase from embryonic day 20 to embryonic day 22. The whole growth intensity was from strong to weak with age increasing. The results of differentiation growth rate and the relative growth coefficient indicated that the brain and heart was premature while gizzard was serotinous; the liver, giz- zard, and spleen occupied the dominant position on embryonic days 16, 18 and 26. Therefore, duck embryos growing process was in a wave type state; different or- gans of duck embryos had different growth and development patterns; the relative growth index could supersede the differentiation growth rate preferably.

2020年江苏地区鸭圆环病毒分子流行病学调查及分离方法的初步研究

为了解2020年江苏地区鸭圆环病毒(DuCV)的流行情况、分子特性及探索其分离方法,通过采集江苏部分地区疑似患鸭圆环病的病、死鸭脏器组织,研磨后提取DNA,运用PCR技术扩增该病毒全基因组并测序,分析其分子流行病学特征,确定遗传谱系。将PCR检测阳性的组织病料上清经绒毛尿囊膜接种9日龄SPF鸭胚,分别收集鸭胚绒毛尿囊膜和尿囊液,以相同的方法将PCR检测阳性的尿囊膜/尿囊液进行鸭胚传代,尝试探索分离DuCV的方法。采集的23份样品中共检测出阳性样本10份。病毒基因组序列分析结果表明10株分离株均属于DuCV 1型的分支,传代结果表明多数样本在第1代绒毛尿囊膜和尿囊液样品中可检出DuCV,仅有部分样本在第2、3代的绒毛尿囊膜PCR检测结果呈阳性,传至第4代次时就检测不到病毒核酸。检测的结果一定程度上也表明绒毛尿囊膜检出率高于尿囊液。该结果为江苏地区该病的防控提供了一定的参考价值。

龙岩山麻鸭胚胎成纤维细胞的培养和鉴定

为培养龙岩山麻鸭鸭胚成纤维细胞。本研究选择龙岩山麻鸭10日龄鸭胚组织,采用组织块法和酶消化法进行成纤维细胞培养,利用免疫荧光法对培养的成纤维细胞进行鉴定。结果表明,培养的鸭胚成纤维细胞12h后呈典型的长梭形,48h后,细胞轮廓清晰,核仁明显,传至第3代的成纤维细胞经DAPI和绿色荧光标记染色后均呈阳性,具有成纤维细胞的特征。本研究成功从龙岩山麻鸭鸭胚组织中分离培养出成纤维细胞,为后期龙岩山麻鸭开展分子生物学和细胞生物学等研究提供良好的基础。

抗鸭坦布苏病毒感染的中草药筛选及其作用效果的初步研究

为筛选抗鸭坦布苏病毒(DTMUV)的中草药并探究其抗病毒作用效果,本研究通过检测12种中草药对DTMUV感染鸭胚成纤维细胞细胞(DEF)形态学与病毒抑制率的影响,以及对DTMUV病毒滴度与病毒载量的影响,筛选在DEF中抗DTMUV效果较明显的中草药;采用鸭胚接种法测定筛选出的3种药物(板蓝根、醋五味子、酒黄芩)对DTMUV感染鸭胚死亡率的影响;并选择效果最好的酒黄芩验证其对DTMUV感染雏鸭死亡率、临床症状、体重及组织(心脏、脾脏)中病毒载量的影响。结果显示:鱼腥草、淫羊藿、金银花、板蓝根、绵马贯众、黄芪、酒黄芩、茵陈、甘草、连翘、醋五味子、白芍水提物在最佳作用浓度时均能减轻DTMUV感染DEF的CPE,并对DTMUV具有不同的抑制率,其中酒黄芩效果最佳;淫羊藿、白芍、板蓝根、黄芪、酒黄芩、茵陈、甘草、醋五味子、连翘能显著降低DEF中DTMUV的病毒滴度(P<0.05);板蓝根、醋五味子、酒黄芩能显著降低DEF中DTMUV的病毒载量(P<0.05);板蓝根、酒黄芩能起到治疗效果,且显著降低鸭胚死亡率(P<0.05),而酒黄芩、醋五味子还能预防病毒感染,且显著降低鸭胚死亡率(P<0.05);酒黄芩能够减轻病鸭临床症状,显著提高病鸭体重(P<0.05),显著降低病鸭死亡率及组织中病毒载量(P<0.05)。综上结果证明板蓝根、酒黄芩、醋五味子在细胞和鸭胚内具有一定抗DTMUV的作用,其中酒黄芩效果最佳,且酒黄芩对DTMUV感染的雏鸭具有治疗作用,可以成为抗DTMUV的潜在药物。

山东部分地区鸭源大肠杆菌耐药性分析

试验旨在了解鸭源大肠杆菌对临床常用抗菌药物的耐药性和耐药基因携带情况,在山东部分地区多个养殖场采集病死鸭肝组织样品220份进行大肠杆菌分离鉴定,通过K-B纸片法测定分离株对18种抗菌药物的耐药性,利用PCR方法检测21种耐药基因。结果显示,于病死鸭肝组织中分离出大肠杆菌36株,分离率为16.4%。分离株对氨苄西林、土霉素、氟甲喹钠、磺胺甲恶唑、林可霉素耐药情况严重,耐药率分别为75.0%、63.9%、58.3%、58.3%、52.8%;对氟苯尼考和新霉素的耐药率分别为41.7%和33.3%;对硫酸黏菌素、甲磺酸加替沙星高度敏感。分离株对3种抗菌药物耐药的最多,占比22.2%;其次是对5种和10种药物耐药,占比均为13.9%。于分离株中检出10种耐药基因,blaTEM、aadA1、sul1、oqxA、floR的检出率为100.0%,所有分离株均存在多种耐药基因共存现象。研究表明,山东部分地区鸭源大肠杆菌耐药严重,且携带多种耐药基因。临床应根据细菌耐药性结果进行合理用药,并持续加强对大肠杆菌耐药性监测。

鸭病毒性肝炎鸭胚灭活疫苗的研究

以鸭病毒性肝炎病毒Ⅰ型ATCC毒株接种健康鸭胚,收集致死的全胚组织作制苗材料,用福尔马林灭活,以麸氨酸钠终止其作用。先后试制疫苗11批,在试验室免疫雏鸭71只,经强毒攻击后,总的保护率为90.4％。本疫苗免疫雏鸭3天后可产生较坚强的免疫力,在室温至少可保存11天,在4℃可保存254天。经在江苏、安徽、广东等省推广应用200000头剂,均安全有效,颇受用户欢迎,对控制鸭病毒性肝炎的流行起了重要作用。

鸭胚骨骼肌成肌细胞中MyoD1和Myf5基因的表达与分析

以高邮鸭和金定鸭为研究对象,采用实时荧光定量PCR方法测定生肌调节因子MyoD1和Myf5基因在不同发育阶段鸭胚(13、15、17、19、21和23胚龄)骨骼肌成肌细胞中的表达水平,分析MyoD1和Myf5基因在鸭胚胎期骨骼肌成肌细胞中的表达模式和差异.结果表明,Myf5和MyoD1基因在胸腿肌成肌细胞中呈现不同的表达规律:胸肌成肌细胞中,Myf5基因的表达呈"低→高→低→较高"的趋势,类似反"∽"形;MyoD1基因的表达呈"低→高→低"的趋势,在金定鸭17胚龄时达到高峰后迅速下降(P<0.01),并维持在低水平,类似"∧"形,而在高邮鸭17胚龄时达到高峰后维持高水平至19胚龄(P>0.05),再下降并维持在低水平(P<0.05),类似"∩"形.腿肌成肌细胞中,Myf5基因的表达呈"低→高→低"的趋势,类似"∧"形;MyoD1基因的表达呈"较高→低→高→低"的趋势,类似"∽"形.结果提示:Myf5和MyoD1基因在骨骼肌成肌细胞中的表达具有时间和品种依赖性;两基因在两品种鸭胸腿肌中均在17胚龄时达到高峰,表明17胚龄可能是成肌细胞分化和增殖的一个重要时期.

鸭疫里默氏杆菌培养滤液对鸭胚成纤维细胞形态的影响

为探索鸭疫里默氏杆菌的致病机制,研究了鸭疫里默氏杆菌培养滤液对鸭胚成纤维细胞形态的影响。结果显示,鸭疫里默氏杆菌AF株的培养滤液能使鸭胚成纤维细胞形态发生变化,表现为细胞膜和细胞质逐渐丢失、核浓缩等;90%(27/30)的鸭疫里默氏杆菌临床分离菌株能液化明胶,具有致病性,培养滤液具有改变鸭胚成纤维细胞形态的生物学活性;10%(3/30)的菌株不液化明胶,无致病性,培养滤液无改变鸭胚成纤维细胞形态的生物学活性;经硫酸铵盐析、阴离子交换、疏水和凝胶过滤层析,从AF株培养滤液中分离获得分子质量约为55 ku、能水解明胶及改变细胞形态的活性蛋白质。证实,降解明胶的蛋白水解酶是鸭疫里默氏杆菌培养滤液影响鸭胚成纤维细胞形态的活性物质,可能是细菌的毒力因子之一。

鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株在鸭胚成纤维细胞中形态发生学的研究

采用超薄切片和透射电子显微镜技术对鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株(DEV-CHv)在鸭胚成纤维细胞(DEF)中的形态发生学进行了研究。结果表明,DEV-CHv吸附到DEF细胞上以后通过囊膜和细胞膜间发生融合的方式侵入宿主细胞;病毒在细胞核内完成病毒核酸的生成、核酸与衣壳的装配;病毒核衣壳通过核膜-内质网膜系统从细胞核转运到内质网池中并在内质网池中得到皮层结构;获得了皮层的DEV-CHv核衣壳通过出芽方式释放到细胞空泡内得到囊膜结构后成为成熟病毒;细胞空泡内的成熟DEV-CHv可通过细胞的胞吐作用被释放到细胞外,或在空泡破裂时被释放到细胞外。

鸭胚成纤维细胞中鸭瘟强毒的增殖特性研究

通过细胞培养物光学显微观察、细胞超薄切片研究、定量PCR检测技术对鸭胚成纤维细胞中鸭瘟强毒的增殖特性进行了研究。结果表明:鸭瘟强毒接种鸭胚成纤维细胞后42h,可使细胞培养物出现大量明显的蚀斑病变。细胞培养物的超薄切片电镜观察研究表明,病毒核酸在胞核内常集中分布,呈直径35～45nm的圆形颗粒状;核衣壳在胞核和胞浆内都有分布,呈直径90～100nm的圆形颗粒状;成熟病毒位于胞浆空泡内,呈直径150～300nm的圆形,有囊膜和皮层结构;病毒通过囊膜与胞膜融合入侵细胞,在核内生成核酸、装配核衣壳,在胞浆中得到皮层,出芽到胞浆空泡内获得囊膜,通过胞吐作用释放到胞外。定量PCR研究表明:鸭瘟强毒接种细胞后10h开始明显复制,接毒后30h时含量趋于稳定,接毒后22h时开始向胞外释放,50h时达最大值,细胞和上清中病毒含量的增幅均为103左右,病毒主要存在于细胞中,其含量为上清的102～103倍。

鸭瘟病毒的纯化及电镜负染形态观察

先做切向超滤浓缩，再采用蔗糖垫底超速离心和蔗糖密度梯度超速离心的方法对鸭胚成纤维细胞培养物中的鸭瘟病毒进行纯化，并对纯化的病毒粒子用电镜进行了观察。结果显示，用切向超滤法将病毒培养物浓缩为原体积的1／5后，再采用300g／L蔗糖垫底超速离心和300-600g／kg蔗糖密度梯度离心的方法进行纯化，可获得大量的纯化病毒粒子。电镜负染观察结果表明，病毒粒子呈圆形，多数直径为150nm左右，只有1个核衣壳，少数病毒粒子直径可达300nm，有2个或多个核衣壳。

鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株感染鸭胚成纤维细胞的超微结构观察

通过超薄切片和透射电子显微镜技术对鸭病毒性肠炎病毒(DEV)CH强毒株在鸭胚成纤维细胞(DEF)中的形态结构进行了研究.结果发现,DEV CH强毒株病毒核酸呈圆形颗粒状,直径35～45 nm,在胞核内常集中分布;病毒核衣壳呈圆形,直径90～100nm,在胞核和胞浆内都有分布;DEV核衣壳可根据所含核酸形态的差异分为空心核衣壳、内壁附有颗粒型核衣壳、同心圆形核衣壳和实心核衣壳;成熟的病毒粒子具有囊膜和皮层结构,呈圆形,直径150～300nm,存在于胞浆空泡内;DEV可在DEF中分别形成胞浆内和胞核内包涵体结构;伴随子代病毒在细胞内的出现,胞浆内还出现豆荚状、马蹄形、半圆形、圆形、同心圆形等与病毒发生有关的电子致密结构.

不同品种鸭胚胎期骨骼肌成肌细胞GHR和IGF-1 mRNA表达差异分析

为探讨生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)和胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)在不同品种鸭胚胎期骨骼肌成肌细胞中的表达差异。选择生长速度不同的金定鸭和高邮鸭为试验动物,采用实时荧光定量PCR方法检测鸭13,15,17,19,21和23胚龄时胸肌和腿肌成肌细胞GHR,IGF-1mRNA的表达情况,并进行了品种间比较。结果发现:13胚龄时,高邮鸭胸肌和腿肌成肌细胞IGF-1的表达均显著高于金定鸭(P<0.05);17胚龄是两个品种鸭GHR和IGF-1共同的表达高峰期;17胚龄之后,鸭胸肌和腿肌成肌细胞GHR和IGF-1表达均显著降低。在19,21胚龄时,高邮鸭胸肌成肌细胞2个基因的表达均显著高于金定鸭(P<0.05),而腿肌成肌细胞GHR和IGF-1表达在品种间无显著差异(P>0.05)。鸭胚胸肌和腿肌成肌细胞GHR和IGF-1表达呈现极显著的正线性相关(P<0.01)。提示:GHR和IGF-1的表达谱及各自在品种间的变化规律基本一致;鸭胚骨骼肌成肌细胞GHR和IGF-1 mRNA表达有组织特异性,二者之间可能存在正调控的作用机制。

鸭胚成纤维细胞培养、传代及保存方法的研究

本研究旨在建立鸭胚成纤维细胞离体培养、传代以及冷冻保存体系,为鸭胚胎或生殖干细胞的离体培养奠定基础。利用胰酶-EDTA消化鸭胚胎组织,10% FBS+DEME营养液培养,获得原代和传代成纤维细胞。分别用DMSO、甘油以及乙二醇作为冷冻保护剂对F1代鸭胚成纤维细胞进行冷冻保存,检测复苏后细胞的生长情况。利用此方法可以获得高活性的鸭胚成纤维细胞,并可成功传至第三代。其中F1代与F2代细胞活力最好,达到90%以上。3种冷冻剂保存的细胞复苏后均与F1代细胞的活力存在明显差异,均小于80%,其中用DMSO冷冻保存的细胞复苏后活力最强,生长密度保持较好。

半番鸭胚中鹅细小病毒的分离鉴定及其基因组分子特征分析

通过胶体金试验、电镜观察及PCR扩增等方法,自半番鸭胚及孵化的雏半番鸭中分离获得了鹅细小病毒(GPV)毒株(命名为MDE株),并进行了病毒全基因组分子特征分析。结果表明,该病毒粒子为直径20~24nm的球形、无囊膜粒子。胶体金试验结果呈GPV阳性。该毒株基因组全长为5 106bp,与GenBank登录的15株GPV基因组序列相似性为93.2%~98.1%,其中与SH株及疫苗株SYG61v株等的相似性较高,而与半番鸭源的GPV重组病毒M15株相似性最低。基于病毒VP1和NS1基因的遗传进化分析表明,分离毒株MDE与GPV疫苗毒株的亲缘关系最近,处于同一个独立的分支上,与番鸭细小病毒的亲缘关系较远。与疫苗毒株SYG61v株比较,MDE株VP1区的糖基化位点增加了703NRTS糖基化位点。以上结果表明,本研究揭示了GPV可通过半番鸭胚垂直传播给雏鸭,丰富了GPV的生态学内容。

鸭胚骨骼肌生肌调节因子MyoD1和Myf5发育性变化研究

本研究采用Real-timePCR分析生肌调节因子MyoD1和Myf5在不同鸭品种(高邮鸭和金定鸭)胚胎期及初生早期(13、17、21、25、27日胚龄和出雏后7日龄)骨骼肌发育中的表达模式以及表达差异。结果表明,MyoD1mRNA和Myf5mRNA在两个品种鸭胸肌早期发育中表现出一致的表达规律,均呈"波浪"型;在腿肌早期发育中均呈近似"反√"型的表达趋势,在27日胚龄时表达量最低,出生后7日龄表达量又上升,但MyoD1mRNA的表达量仅有小幅增加,与27日胚龄的表达量差异不显著(P>0.05),而Myf5mRNA的表达量有大幅增加,与27日胚龄的表达量差异极显著(P<0.01),胸肌和腿肌中两基因的mRNA表达量在同一胚龄不同品种间差异均不显著。结果提示:骨骼肌中MyoD1和Myf5基因表达具有显著的时空性,但不存在品种差异,为进一步深入研究MyoD1和Myf5基因在胚胎期骨骼肌发生过程及其调控机理中的功能提供一定的理论依据。

应用鸭胚组织培养液酶活性进行蛋鸭早期选种的研究

根据亲代产蛋性能,将10个家系320个13日龄的鸭胚分成Ⅰ和Ⅱ两组,进行活组织培养,测定培养液中的碱性磷酸酶(AKP)和谷草转氨酶(GOT)的活性。结果:AKP活性与其亲代产蛋指数、半同胞姐妹鸭的开产日龄和500日龄产蛋数有密切相关,其相关系数分别为0.8736、-0.6616和0.7954;GOT活性与上述性能的相关系数分别为-0.7737、0.4331和-0.9024。AKP活性高、GOT活性低的Ⅰ组比AKP活性低、GOT活性高的Ⅱ组,其半同胞姐妹鸭开产日龄提早18.8天(P<0.01);500日龄产蛋数多21.8个(P<0.05)。AKP和GOT活性的遗传力分别为0.7993和0.3410,它们间的关系为负相关,相关系数为-0.8641。根据鸭胚组织培养液中的AKP和GOT的活性,对蛋鸭进行早期选种,比常规选种法可提早半年。

3种消毒剂对鸭肝炎病毒的杀灭效果试验

以 1 0日龄鸭胚为试验载体 ,检验 3种消毒剂对鸭肝炎病毒 (DHV Ⅰ )野毒株的杀灭效果。将一定剂量的DHV Ⅰ感染鸭胚尿囊液分别与四烷铵络合碘、二氯异氰脲酸钠、百毒杀(双链季铵盐类消毒剂 ) 3种消毒剂的不同浓度混合作用后 ,接种鸭胚继续孵化 ;计算鸭胚死亡比例 ,测定各种消毒剂对DHV Ⅰ的杀灭效力。结果显示 :0 .0 4%的二氯异氰脲酸钠能有效灭活DHV Ⅰ ,显著降低试验鸭胚的死亡率 ;显示了较好的消毒效果 。

实时荧光定量PCR技术在鸭胚鸭瘟病毒检测中的应用

用real-time PCR技术定量检测了鸭瘟标准强毒（DPV F37）和鸡胚化弱毒（C-KEC）疫苗毒在鸭胚中的动态分布．结果表明，F37在接种后3～45h内胚体和绒毛尿囊膜中的病毒荷载量为7．43×10～5．01×10^3拷贝·μL^-1，57-69h达到平台期，为1．7×10^4～4．04×10^4拷贝·μL^-1，接种后9～81h尿囊液中的DPV荷载量始终在2．13～5．11×10^2拷贝·μL^-1，胚体和绒毛尿囊膜中病毒荷载量高于尿囊液，病毒收获时间以接种后69～81h为宜；C-KEC接种鸭胚后3h尿囊液中病毒荷载量为7．6×10^3拷贝·μL^-1，9h下降至1．94×10^2拷贝·μL^-1，21h呈阴性．以后快速上升到平台期达9．16×10^3拷贝·μL^-1；而绒毛尿囊膜在21h前、胚体在45h前的检测均为阴性，之后快速上升，均在69h达到平台期，为6．40×10^4·μL^-1及4．14×10^4拷贝·μL^-1，C-KEC在鸭胚绒毛尿囊膜及胚体中的含量同样高于尿囊液，收毒时间以接种后69～81h为佳；对real-time PCR与空斑法两种定量检测结果进行相关性分析，结果显示，两者存在显著的直线相关，说明Real-time PCR技术完全可以替代空斑法定量检测DPV，并可将检测时间由144h缩短至3h．

鸭胚胎及其头与四肢生长发育的研究

对仙湖肉鸭胚胎及其头与四肢部分性状的重量和长度进行了测定与分析。结果表明,不同性状有着各自不同的生长发育规律,并表现出明显的不平衡性。生长强度表现为前期强后期弱的趋势。胚重的生长速度随着胚龄的增加而增加。头重、前肢和后肢重以及胚长、前肢、后肢、胫和第三趾长的生长速度表现为正态分布的变化趋势。头长、眼泡直径和喙长在分化出现后,立即进入快速生长阶段,在第8～12胚龄之后生长速度减缓。在第8～26胚龄期间,头为早熟部位,前肢和后肢为晚熟部位,前肢的重量生长先于后肢。