病原迟钝爱德华菌毒力基因及双重PCR与LAMP检测方法的建立

为明确牙鲆及大菱鲆病原迟钝爱德华菌毒力基因的携带情况并建立分子检测方法,实验以迟钝爱德华菌fimA、fimB、gadB及citC为靶基因设计特异性引物,进行PCR扩增及环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),并对其特异性、灵敏性和实际应用进行了比较。结果显示,10株病原迟钝爱德华菌均扩增出fimA、fimB、gadB及citC 4种毒力基因,目的条带大小分别为240、217、171及119 bp,4株对照菌无任何扩增条带;以fimA和gadB设计的两对引物进行的双重PCR扩增,同一PCR反应体系中病原迟钝爱德华菌可扩增出240和171 bp两条目的条带,且灵敏度为3.0×103CFU/mL,4株对照菌无任何扩增条带;以fimA设计的4条特异引物进行的LAMP扩增,病原迟钝爱德华菌可扩增出阶梯状条带,反应产物加入荧光染料SYBR GreenⅠ后反应液呈现明显的绿色阳性反应,4株对照菌无阶梯状扩增条带且呈现橙色阴性反应,灵敏度为3.0×101CFU/mL,比双重PCR的检测限要低100倍。研究表明,操作简便、快速且特异性及灵敏性强的LAMP检测方法,对迟钝爱德华菌引起的水产动物疾病的快速诊断具有实践意义。

水产动物致病性副溶血弧菌双重PCR检测方法的研究

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是多种水产养殖动物的主要病原菌,尤其是可引起凡纳滨对虾幼虾呈毁灭性死亡。本研究基于gyrB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种副溶血弧菌快速、准确的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为285 bp和368 bp。结果表明在同一PCR反应体系中副溶血弧菌可同时扩增大小分别为285 bp和368 bp的2种基因片段,两种引物对4种其他水产动物病原菌无交叉反应;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测8.867 2×103 CFU/mL菌体浓度的副溶血弧菌,对副溶血弧菌模板DNA的检出极限为0.029 3 mg/L;对发病中国对虾糠虾幼体、水产品及虾池养殖用水进行双重PCR检测,呈阳性反应的样品可分离出优势生长的副溶血弧菌。该实验所建立的基于gyrB和toxR两种基因的双重PCR检测方法可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及分子流行病学的调查研究。

水产品中副溶血性弧菌特异性二重PCR检测方法的研究

建立快速检测水产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahae-molyticus)的二重PCR方法。以副溶血性弧菌特异性基因tlh和toxR为靶基因,选择2对引物,对5株副溶血性弧菌和40株非副溶血性弧菌进行特异性检测;梯度稀释副溶血性弧菌基因组DNA,以不同稀释度DNA作PCR扩增;在鱼肉样品中以不同菌量人工污染,不同增菌时间培养,提取DNA进行PCR扩增;应用该方法对实际样品进行检测。以tlh和toxR为靶基因的两对引物对副溶血性弧菌的检出有很好的特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到28.76pg;人工污染样品,当起始污染量为1CFU/mL时,37℃增菌培养10h即可检出。本试验一共检测了21份水产品样品,有14份检出了副溶血性弧菌。

基于lolB和toxR基因的水产品中霍乱弧菌双重PCR检测方法

选择lolB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种针对霍乱弧菌所有生物型菌株的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为519bp和779bp。结果表明:在同步扩增中,仅霍乱弧菌模板可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌模板无任何扩增条带;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测3.42×103CFU/mL菌落数的霍乱弧菌。所建立的基于lolB和toxR两种基因的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于霍乱弧菌检测。

PRV和PCV2二重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立同时检测猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)2种病毒的多重PCR,设计2对PRV和PCV2特异性引物,建立同时检测这2种病毒的二重PCR方法,并对采自呼吸障碍病猪的病料进行检测。结果表明,PRV和PCV2扩增产物分别为359bp和482bp,最小DNA质量分别是2.7pg和4.3pg。采自河南省的80份样品的总阳性率为85%(68/80),其中PRV和PCV2阳性率分别为28.8%(23/80)和77.5%(62/80),混合感染率达25%(17/68)。该多重PCR检测方法敏感、特异、快速,可用于临床样品PRV和PCV2检测。

双重PCR法检测冷冻淡水水产品中单核细胞增生性李斯特菌的研究

目的建立一种快速有效地检测出口冷冻淡水水产品中单核细胞增生性李斯特菌的方法。方法以李斯特菌属特异性iap基因和种特异性hly基因为靶序列,建立双重PCR方法;比较和优化3种提取模板的方法;通过干扰实验、模拟污染实验等验证了所建方法的稳定性、特异性、敏感性;并与SN0184-93方法和mini-VIDAS方法进行比较。结果建立的方法稳定性强、特异性和敏感性好,检测限度为3cfu/25g样品,检测结果与SN0184-93方法和mini-VIDAS方法的一致性为100%;该方法可直接使用单核细胞增生性李斯特菌菌液作为模板进行扩增。结论建立的双重PCR方法可快速、敏感,特异地检测出口冷冻淡水水产品中单核细胞增生性李斯特菌。

食品中沙门菌特异性二重聚合酶链反应检测方法的研究

目的建立二重聚合酶链反应(PCR)方法快速检测食品中的沙门菌(Salmonella spp.)。方法以沙门菌特异性基因invA、hilA为靶基因,选择2对引物对16株沙门菌和24株非沙门菌进行扩增,验证二重PCR的特异性。梯度稀释DNA,以不同稀释度的DNA PCR扩增。在猪肉中以不同菌量人工污染,不同增菌时间培养,提取DNA进行PCR扩增。应用该方法检测实际样品。结果以invA、hilA为靶基因的两对引物对沙门菌的检出均有很好的特异性,PCR能检出0.1332pg的沙门菌DNA,人工污染猪肉的检测限为2.5cfu/ml。本研究共检测了53份食品样品,有21份检出了沙门菌。结论建立了适用于肉类、水产品及蛋糕等食品中的沙门菌检测的快速、灵敏、特异的二重PCR方法。

基于toxR和rtxA基因水生动物2种病原弧菌的同步检测方法的建立

本研究选择副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的toxR和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的rtxA基因序列设计2对特异性引物,建立了在同一反应体系中同步检测2种病原菌的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为368bp和417bp。特异性试验结果表明,在同一反应体系下,副溶血弧菌和霍乱弧菌扩增出目的条带,其他4种对照病原细菌无任何扩增条带;单一及双重PCR敏感性试验结果表明,稀释浓度在(109～102)CFU/mL,单一PCR与双重PCR均可扩增出目的条带,且单一PCR与双重PCR表现出了相同的灵敏度(102 CFU/mL),表明本实验优化的双重PCR反应条件良好;人工染菌样品均可扩增出两条目的条带,表明该方法可直接用于针对病原副溶血弧菌和霍乱弧菌感染的水生动物疾病的检测以及水产品的安全检测,在水产品致病菌的风险评估和大规模样本的分析检测领域具有较高的潜在应用价值。