中国人dystrophin基因RFLPs的初步研究

我们用dystrophin基因的cDNA全顺序(长14 kb)为核酸分子杂交探针,对中国人dystrophin基因内的RFLPs进行了初步研究。在结果中给出了PvuⅡ/1 a、Taq Ⅰ/2 b—3、PvuⅡ/2 b—3、TaqⅠ/5 b—7、Xba Ⅰ/10五种杂交中所见的六个RFLPs 的预期杂合频率和受检女性的实际杂合频率;其中PvuⅡ/2 b—3(A 1=26.0 kb,A 2=3.8 kb)和Taq Ⅰ/5 b—7(A 1=10.0 kb,A2=8.4 kb)的2个RFLPs为本文首次报道。PvuⅡ/1 a的2个RFLPs 的等位片段频率与日本人的同类研究结果比较,差异无显著性。但Taq Ⅰ/2 b—3、Taq Ⅰ/5 b—7、Taq Ⅰ/8、EcoR Ⅴ/9和Xba Ⅰ/10的5个RFLPs 与高加索人的数据比较,发现其中4个RFLPs 的等位片段频率的差异有极其显著性。这提示了东西方人在dystrophin 基因的分子结构上存在着较大的差别。在这些差异之中,Taq Ⅰ/2 b—3、Taq Ⅰ/8和EcoR Ⅴ/9检出的RFLPs 等位频率,中国人低于高加索人;而Xba Ⅰ/10检出的RFLPs 等位频率则显著高于高加索人;另外Taq Ⅰ/5 b—7检出的RFLPs的等位片段频率则与高加索人相近。实验结果还提示PvuⅡ/1 a、Taq Ⅰ/5 b—7和Xba Ⅰ/10这三种杂交,对于在中国人群中检测DMD/BMD 基因携带者以及产前诊断,具有很高的应用价值。

病毒性心肌炎和扩张性心肌病中Dystrophin蛋白的表达

目的探讨病毒性心肌炎和扩张性心肌病的发病机制及相互关系,从而提高心性猝死法医学鉴定的可靠性和准确性。方法对17例对照(包括正常心脏、冠心病、高血压性心脏病等),25例病毒性心肌炎和28例扩张性心肌病的心肌组织进行改良的病理学dystrophin免疫组织化学研究。结果dystrophin蛋白在对照组,病毒性心肌炎组和扩张性心肌病组中阳性表达率分别为100%,88%,57%,三组表达差异有显著性(P<0.05),且在病毒性心肌炎和扩张性心肌病组间表达有显著差异(P<0.05),经Spearman等级相关分析呈显著负相关(r=-0.526)。结论病毒性心肌炎和扩张性心肌病心肌中细胞骨架蛋白均有破坏,且随着由病毒性心肌炎进展为扩张性心肌病,dystrophin蛋白表达逐渐降低,说明在病毒性心肌炎和扩张性心肌病的发病机制中可能与dystrophin的被破坏有关,病毒感染并破坏心肌细胞骨架蛋白并最终导致心肌细胞坏死,心功能受损,从而使病毒性心肌炎进展为扩张性心肌病。

Dystrophin在不同类型肌营养不良症中的变化及诊断价值

目的 研究dystrophin在不同类型肌营养不良症中的变化及分型诊断价值。方法 用抗dyshophin抗体对107例肌营养不良症患者肌组织标本行免疫组织化学分析。结果Duchenne型肌营养不良（DMD）患者肌细胞膜上无显色,Becker型肌营养不良（BMD）患者肌细胞膜上显色浅淡、不连续或呈斑片状。肢带型肌营养不良（LGMD）患者肌细胞膜上染色正常。结论dystrophin免疫组化染色对于年龄较小临床不易区分的DMD/BMD患者,可区分开来,以早期预测功能影响程度。该方法也有助于区分临床表现相似的成年散发BMD和LGMD患者,对于正确地进行遗传咨询具有重要意义。

Dystrophin基因51号外显子缺失连接片段的克隆和测序

为了解Dystrophin基因缺失断裂点和连接片段的序列特点 ,以分析Dystrophin基因缺失的分子机制 ,利用巢式反向PCR克隆了 1名 5 1号外显子缺失DMD(DuchenneMuscularDystrophy ,DMD)患者的缺失连接片段 ,通过测序 ,确定 5′和 3′断裂点及连接片段的序列。对 5′、3′断裂点和连接片段进行重复序列、TOPOI、TOPOII酶切位点等分析。结果共测得 5 0号内含子 16 14bp ,确定该患者Dystrophin基因的 5′断裂点位于THE1(Transposon likeHumanElement,THE)内 ,3′断裂点位于L2序列内。连接片段有 3bp的连接同源序列cta ,局部无小的缺失、插入和碱基置换。本研究首次在 5 0号内含子内发现一THE1序列 ,再次发现Dystrophin基因的缺失断裂点位于THE1结构内。反向PCR操作简单、耗时短 ,可以推扩应用于缺失连接片段的克隆 ;THE1可能与部分Dystrophin基因的缺失有关 ;Dystrophin基因缺失大多与同源重组无关 ,非同源末端连接可能参与了Dystrophin基因缺失的形成。

Micro-dsytrophin基因修饰的骨髓间充质干细胞移植后mdx鼠腓肠肌病理改变及micro-dystrophin的表达

目的探讨自体骨髓间充质干细胞(mMSCs)携带micro-dystrophin基因在移植鼠体内分化为有功能肌细胞的可能性。方法采用脂质体介导micro-dystrophin基因转染mdx小鼠mMSCs,通过尾静脉注射移植治疗mdx鼠,在移植后不同时间点对腓肠肌进行HE染色、计数核中心移位纤维(CNF)比例,并用免疫荧光法检测micro-dystrophin的表达。结果移植后各时间点腓肠肌病理改变较对照组有所改善,CNF比例下降,差异有统计学意义,部分肌细胞膜能表达micro-dystrophin蛋白,并随移植时间延长micro-dystrophin阳性肌纤维比例增加,分别达到3%(8周时)、6%(12周时)和8%(16周时)。结论自体mMSCs可携带外源性micro-dys-trophin基因在受体鼠体内分化为micro-dystrophin阳性肌细胞。

磷酸肌酸治疗Dystrophin缺失型肌营养不良临床研究

目的研究磷酸肌酸对进行性肌营养不良的治疗效果。方法20例确诊为Dystrophin缺失型进行性肌营养不良患儿静脉应用磷酸肌酸2周,比较治疗前后血清肌酶与临床症状改善情况,并对患者进行随访。结果20例中14例肌酶较治疗前有显著下降,6例无改变,差别有显著统计学意义(P<0.05)。随访15例中,12例于停用磷酸肌酸后1.5～2个月血肌酶恢复至治疗前水平,临床症状无明显改变或缓慢进行性加重。结论磷酸肌酸能显著降低血清肌酶,但药效维持时间短。

骨髓干细胞移植后mdx鼠腓肠肌病理及Dystrophin的表达变化

【目的】研究骨髓干细胞移植后mdx鼠腓肠肌组织病理变化及dystrophin的动态表达变化。【方法】7～9周mdx鼠20只平均分为4组,放疗后移植1.2×107个/只同种异基因全骨髓干细胞,于移植后4周、8周、12周及16周应用HE染色观察细胞形态及核中心移位(CNF),免疫组化及Westernblot方法检测dystrophin表达变化,C57鼠和未治疗mdx鼠各5只作阳性和阴性对照。【结果】C57鼠腓肠肌横切面可见肌细胞大小形态基本一致,无核中移现象。各细胞移植治疗组和对照组mdx鼠均有大量的炎细胞浸润,核中心移位明显。未治疗mdx鼠CNF最高,可达70%左右,移植后4周、12周和16周,CNF比例分别为55%、50%和44%。免疫荧光结果C57鼠肌膜呈完整的网状绿色荧光,mdx鼠肌膜基本未见绿色荧光;移植后4周肌膜dystrophin阳性纤维数大约占细胞总数的1%,随时间延长表达渐渐增多,8周、12周和16周时阳性细胞数分别占细胞总数的5%、10%和15%。Westernblot结果mdx鼠无dystrophin的表达,野生型C57鼠表达量最多,移植后4周mdx鼠仅见微弱表达,随时间延长表达量渐增,移植后16周表达量较移植8周明显增加。【结论】骨髓干细胞移植后mdx鼠腓肠肌CNF随移植时间延长逐渐减少,dystrophin的表达随时间延长增多,提示骨髓干细胞移植后长久持续参与受损骨骼肌的修复与再生。

经micro-dystrophin基因修饰后的自体骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究

目的探讨携带micro-dystrophin基因的自体骨髓间充质干细胞(mMSCs)在移植鼠体内分化为有功能肌细胞的可能性。方法采用逆转录病毒介导micro-dystrophin基因转染mdx小鼠MSCs(mMSCs),通过尾静脉注射移植治疗mdx鼠,在移植后不同时间点并检测血清激酶(CK)值,对腓肠肌进行HE染色、计数核中心移位纤维(CNF)比例,并用免疫荧光法,、逆转录-聚合酶链反应、Westernblot检测测micro-dystrophin的表达。结果移植后各时间点血CK值下降,腓肠肌病理改变较对照组有所改善,CNF比例下降,差异有统计学意义,部分肌细胞膜能表达micro-dystrophin蛋白,并随移植时间延长micro-dys-trophin阳性肌纤维比例增加,分别达到1%(8周时)、7%(12周时)和15%(16周时)。RT-PCR和Westernblot也发现,随着移植时间的延长,micro-dystrophin表达增加。结论自体mMSCs可携带外源性micro-dystrophin基因在受体鼠体内分化为micro-dystrophin阳性肌细胞。

Micro-dystrophin基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗后mdx鼠MyoD和devMHC的变化

目的观察经人微小抗肌萎缩蛋白(Micro-dystrophin)基因修饰的骨髓间充质干细胞(mMSCs)移植治疗的mdx小鼠成肌调节因子(MRFs)的表达。方法采用脂质体介导Micro-dystrophin基因转染mdx小鼠的mMSCs通过尾静脉注射转染外源基因的mMSCs移植治疗mdx鼠,在移植后4周、8周、12周、16周分别应用免疫荧光、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot三种方法检测腓肠肌内MRFs肌分化因子(MyoD)和发育肌球蛋白重链(devMHC)的表达。结果免疫荧光结果显示对照组腓肠肌有少许MyoD表达,阳性率为(5.2±0.31)%,移植后4周组为(8.4±0.52)%,移植12周组为(19.8±1.63)%,移植16周组为(15.4±1.37)%。对照组腓肠肌可见少量devMHC表达,阳性率为(1.1±0.18)%,移植后4周组为(7.4±1.33)%,移植12周组为(15.8±2.95)%,移植16周组为(21.9±3.62)%。移植后各组MyoD及devMHC阳性率较对照组升高(P<0.05),移植后一组与前一组比较差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测MyoD和devMHC的mRNA表达,Western blot检测MyoD和devMHC蛋白表达,移植后8周组MyoD表达灰度比值较对照组增高(P<0.05),12周时最高,16周组较12周组下降;移植后8周组devMHC表达较对照组及4周组增加(P<0.05);12周组较8周组升高(P<0.05);16周组较12周组升高,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论以Micro-dystrophin基因修饰的MSC移植治疗mdx鼠可能通过激活MRFs的序列表达而促进成肌分化。

多重聚合酶链反应分析Dystrophin基因缺失突变

应用ｍＰＣＲ技术、Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因的１４对外显子扩增引物对２６例ＤＭＤ／ＢＭＤ患者进行了基因缺失性分析。其中１６例的Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ基因出现缺失突变，占６１．５％。缺失突变（１３／１６）主要发生在基因中央突变热点区（ｅｘｏｎ４３－５１），特别是ｅｘｏｎ４８更是缺失突变的集中位点（１０／１６）。本文对Ｃｈａｍｂｅｒｌｉａｍ９对引物的扩增条件作了一定修改，并用扩增Ｃｈａｍｂｅｒｌｉａｎ引物的反应条件和参数扩增５对Ｂｅｇｇｓ引物，获得良好结果。

骨髓胚胎样干细胞体内重建dystrophin的表达

目的观察骨髓胚胎样干细胞体内再生dystrophin的可行性。方法采用SSP-PCR方法鉴定mdx小鼠的基因型。分离扩增人骨髓胚胎样干细胞,采用DIR标记后,注射细胞到mdx小鼠腹股沟三角皮下,采用活体成像法观察植入细胞的存活情况,采用免疫荧光染色法检测dystrophin的表达。结果杂合子鼠交配可以产生3个基因型的子代鼠,采用SSP-PCR可以鉴定出mdx小鼠基因型;采用无血清培养基可从骨髓中分离到表达SSEA-4和FZD-9的胚胎样干细胞,可在注射细胞的mdx小鼠离体后肢肌肉检测到明显的荧光信号,并在肌肉组织中检测到人dystrophin的表达。结论人骨髓胚胎样干细胞可在mdx小鼠体内存活并表达dystrophin。

皮肤成纤维细胞中Dystrophin基因的表达研究

目的研究皮肤成纤维细胞中Dystrophin mRNA和Dystrophin蛋白的表达。方法组织块法体外培养正常鼠皮肤成纤维细胞,通过RT-PCR和Western blotting技术分别检测皮肤成纤维细胞中Dystrophin mRNA及Dystrophin蛋白的表达。结果Dystrophin mRNA和Dystrophin蛋白在培养的皮肤成纤维细胞中均无表达。结论皮肤成纤维细胞可作为细胞间遗传物质转移的供体细胞。

dystrophin基因常见易缺失外显子片段的克隆和鉴定(英文)

背景:dystrophin基因是人类常见的X染色体连锁隐性遗传的神经-肌肉系统疾病,dystrophin基因缺失集中在两个热点区域即外显子2～20和44～53,其主要缺失可以通过对一系列外显子的检测来发现。然而对dystrophin基因缺失的18个常见易缺失外显子片段的系统检测却鲜有报道。目的:拟对dystrophin基因18个常见易缺失外显子片段进行克隆、鉴定。方法:以人类基因组DNA为模板,应用18对引物对dystrophin基因常见易缺失外显子片段进行PCR扩增。将扩增产物与pGEM-TEasy载体连接,转化E.coliJM109感受态细胞。通过平板培养,挑选阳性克隆。提取重组质粒,NotI酶切,获得完整的探针片段,并作测序鉴定。通过核酸序列数据库相似性检索工具验证序列的来源及其与GeneBank收录序列的相似性。结果与结论:PCR扩增出18个片段,与dystrophin基因预期扩增片段大小相一致。重组克隆质粒的酶切产物与PCR产物大小相近,与预期相一致。经测序获得18个克隆片段全序列,其核苷酸数量与预期基本一致,序列相似性检索分析证实了这些克隆片段与GeneBank收录的dystrophin基因片段具有极高的同源性。克隆产物确为dystrophin基因常见易缺失外显子片段。

Dystrophin相关蛋白—Utrophin的研究进展

近年来 ,DMD基因诊断技术已取得了很大进展 ,可是 DMD基因治疗的研究却仍举步唯艰。随着基因治疗 DMD模型 mdx鼠研究的进一步深入 ,使 DMD基因治疗迈上了一个新台阶 ,而 Dystrophin相关蛋白— U trophin的发现 ,则更为

假肥大型肌营养不良患儿的肌肉病理及dystrophin免疫组化SP法检测的临床意义

目的探讨肌肉病理及抗肌萎缩蛋白（dystrophin）免疫组化SP法检测在假肥大型肌营养不良诊断中的临床价值。方法通过组织学观察和免疫组化SP法检测方法,对50例假肥大型肌营养不良患儿[40例Duchenne型营养不良（DMD组）,10例Becker型营养不良（BMD组）]肌纤维膜dystrophin的表达、肌肉病理改变及临床表现进行观察,并与30例其他疾病（多发性肌炎3例、皮肌炎6例、糖元累积病1例、脂质累积病15例、周围神经病2例、脊肌萎缩症3例）对照组患儿进行对比分析。结果肌肉病理显示：DMD组中有30例肌肉病理改变较重,10例较轻;BMD组的肌肉病理改变较轻,这些均与年龄有关。免疫组化显示：DMD组肌肌纤维膜均有严重的dystro-phin缺失,BMD组肌纤维膜有50%~70%的dystrophin缺失;对照组无dystrophin缺失。结论肌肉病理及dys-trophin SP免疫组化检测对假肥大型肌营养不良具有较大的临床意义。

计算机三维重构验证Dystrophin疏水区段与Duchenne型肌营养不良的发病(英文)

背景:Duchenne型肌营养不良和Becker型进行性肌营养不良都是dystrophin基因突变所致,但后者临床表型较轻。"阅读框规则"可解释大部分基因型与临床型关系,但累及疏水区段的整码突变也可导致Duchenne型肌营养不良。因此很有必要了解疏水区域在dystrophin中的功能,且这些疏水区段的三维结构及功能在发病机制中所起的具体作用仍未阐明。目的:通过Kyte&Doolittle平均疏水轮廓分析研究dystrophin的疏水区段。利用swiss-model三维重构dystrophin的疏水区段阐述其在发病机制中所起的作用。方法:参考莱顿开放数据库(http://www.dmd.nl/)及收集中山大学附属第一医院2002年至2013年确诊Duchenne型进行性肌营养不良或Becker型进行性肌营养不良的缺失型整码突变患者资料共1 038例,分析其临床型与基因型关系。使用bioedit软件计算dystrophin的平均疏水轮廓及利用swiss-model三维重构疏水区段,结合临床型和基因型关系确定dystrophin重要功能区。结果与结论:dystrophin存在4个疏水区段,分别为肌动蛋白结合区内的Calponin同源区2、中央棒区内的重复区16、第三铰链区和EF手型区。第1,2,4疏水区段是dystrophin糖蛋白复合物中dystrophin与其他糖蛋白的结合区域,其破坏严重影响dystrophin糖蛋白复合物功能,临床症状重。中央棒区在第三铰链区附近断裂后,HⅢ的无规则卷结构不容易与断端重复区的螺旋结构恢复连接。但第三铰链区同时缺失,其两端的重复区较容易重新连接,所以第3疏水区破坏后其临床症状反而较轻。提示dystrophin的疏水区段是其重要功能区,多是dystrophin糖蛋白复合物中dystrophin与相关蛋白的结合部位,在Duchenne型肌营养不良的发病机制中起重要作用。

正常人群中发现Dystrophin基因外显子缺失的分子遗传学分析

目的对存在Dystrophin基因外显子缺失家系进行分子遗传学诊断,分析该家系Dystrophin基因突变情况及临床表型,探讨该基因缺陷的分子遗传学基础,为临床遗传咨询提供更多的咨询意见。方法采用染色体微阵列分析技术对胎儿染色体进行拷贝数变异分析,应用多重链接依赖探针扩增技术对胎儿Dystrophin基因进行外显子缺失检测,同时对家系其他成员进行Dystrophin基因外显子进行检测。结果染色体微阵列分析技术发现胎儿Xp21.1(31,738,181-31,806,661)缺失,多重链接依赖探针扩增技术检测出Dystrophin基因外显子51~52缺失,家系女性均为Dystrophin基因外显子51~52缺失携带者,两位男性为Dystrophin基因外显子51~52缺失半合子,一位男性未发现Dystrophin基因外显子缺失。结论 Dystrophin基因缺失突变可出现于正常人群,Dystrophin基因缺失突变不一定导致Duchenne/Becker型肌营养不良,为临床基因诊断及遗传咨询提供了重要依据。

Dystrophin基因第51号外显子的缺失机制的研究

用DMDcDNA8探针从Dystrophin基因的YAC克隆的Cosmid亚克隆库中筛选到含Dystrophin基因的第51号外显子Cosmid克隆，将该Cosmid亚克隆于pUC118中，获得合Dystrophin基因第51导外星子的3.1kb—HindⅢ片段的亚克隆，该片段的长度为3179bp，含Dystrophin基因第家51号外星子的全部和第50和第51导内含子的部分，对第50和51号内含子的核苷酿顺序分析表明，在这两个内台子中共发现36个短段串联重复顺序．22正向和反向重复顺序和8个同原顺序。提出重复顺序之间的重组可能导致第51号外显子缺失的假设。

低氧调控离心运动后大鼠骨骼肌Dystrophin的表达

目的观察急性离心运动后低氧暴露对大鼠腓肠肌细胞膜通透性及膜骨架蛋白dystrophin的影响,探讨骨骼肌细胞膜损伤的作用机制,为高住低训提供理论依据。方法 70只雄性SD大鼠分为安静对照组、运动后常氧恢复24 h、48 h、72 h组和运动后低氧暴露24 h、48 h、72 h组。运动后低氧暴露组在离心运动后于常压低氧环境中进行恢复。采用免疫组化、Western blot、qRT-PCR等方法检测大鼠腓肠肌细胞膜完整性和dystrophin蛋白及基因表达。结果 (1)离心运动后低氧暴露,大鼠腓肠肌阳性细胞率在各时间点与常氧恢复组比较,呈现显著性上升、下降再上升的趋势;(2)急性离心运动后,dystrophin蛋白含量在各组中未出现显著性变化;(3)常氧恢复组和低氧暴露组dystrophin mRNA表达水平均显著性低于安静对照组。结论 (1)离心运动后急性低氧暴露可加剧骨骼肌细胞膜的损伤,随着低氧暴露时间的延长,机体虽然产生了短暂适应,但其恢复速率仍较常氧下恢复低;(2)膜骨架蛋白dystrophin在运动后无论是常氧恢复组还是低氧暴露组,并未发生显著性变化,且其基因表达与蛋白变化在时间上存在一定滞后,提示除mRNA转录调节之外,可能存在一种转录外调节机制;(3)"高住低训"的训练方案并不利于运动后骨骼肌的快速恢复。

河南省杜氏肌营养不良患者dystrophin基因突变的MLPA检测

目的:探讨多重连接依赖式探针扩增技术(MLPA)在杜氏肌营养不良(DMD)患者基因诊断中的应用价值,了解河南省DMD患者dystrophin基因突变热点。方法:采用MLPA检测48例河南省DMD患者及13例缺失型患者母亲dystrophin基因突变。结果:48例DMD患者中,有31例(64.6%)检测出dystrophin基因外显子缺失,4例(8.3%)检测出外显子重复。河南省DMD患者dystrophin基因缺失/重复热点区域为第46～53外显子和第8～18外显子。13例患者母亲有11人检测出杂合突变,突变类型与患者相同,余2人未检测出突变。河南省DMD患者基因外显子缺失、重复分布与北京相似(χ2=0.256,P=0.880),但与香港和台湾地区有着较大差异(χ2分别为11.470和11.303,P分别为0.003和0.004)。结论:MLPA在DMD患者及携带者基因诊断中有很高的应用价值。河南省DMD患者dystrophin基因的突变热点与国内其他地区有差异。