E-64d对大鼠视网膜缺血再灌注损伤中Calpain和Caspase-3表达的调控作用

目的探讨E-64d(半胱氨酸蛋白酶抑制剂及钙激活中性蛋白酶抑制剂)在大鼠视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)中对Calpain/Caspase-3表达的调节作用。方法将80只SD大鼠随机分为正常组、视网膜缺血再灌注组、对照组和E-64d治疗组,并分为1、3、6、24、72h5个时间段。通过前房穿刺加压法制成RIRI动物模型,采用Western-blot以及RT-PCR方法测定在大鼠RIRI模型中的Calpian、Caspase-3蛋白和mRNA表达情况。结果缺血再灌注24hm-Calpain、Caspase-3蛋白的表达缺血再灌注组较正常组上升,而E-64d组表达与正常组相似,比缺血再灌注组下降。E-64d能下调视网膜缺血再灌注后m-Calpain/Calpastatin的mRNA比值,在24h与缺血组有显著统计学差异。结论E-64d能降低视网膜缺血再灌注时m-Calpain、Caspase-3蛋白的表达,调控m-Calpain和Calpastatin的mRNA比值。

钙蛋白酶抑制剂E-64d对高钙诱导的白内障的保护作用

目的：探讨钙蛋白酶抑制剂E-64d对高钙诱导的白内障的保护作用及其作用机制。方法：取健康清洁级兔的16对离体透明晶状体,将一对晶状体的任意一只为实验组,另一只为对照组,实验组为含浓度±次为5,10,15,20,25,30,35,40mmol/L CaCl2的1640培养液,对照组含1640培养液,观察培养36h后晶状体的混浊情况。取健康清洁级兔的24对离体透明晶状体,将一对晶状体的任意一只为实验组,另一只为对照组,实验组为含有CaCl2（5～30mmmol/L）＋E-64d的1640培养液,对照组为含CaCl2（5～30mmol/L）的1640培养液,检测两组晶状体的透明度及相对灰度值,用原子吸收分光光度计检测两组晶状体的钙离子（Ca2＋）含量。采用SPSS11.9统计学软件进行统计学分析,计量k料采用x軃±s表示,采用配对t检验,以P〈0.05为差异有统计学意义。结果：透明晶状体在含有氯化钙的培养液中发生混浊,且随着钙离子浓度的升高,晶状体的混浊程度也提高,当培养液中钙离子浓度为30mmol/L以上时,培养液中的晶状体下方的黑色十字线几乎不能透见,晶状体皮质几乎完全混浊;含有钙蛋白酶抑制剂E-64d的实验组晶状体的混浊程度较对照组明显减轻,实验组与对照组晶状体灰度值比较,差异有显著统计学意义（t=3.820,P=0.001〈0.01）,但实验组与对照组晶状体钙离子含量比较,差异无统计学意义（t=2.144,P=0.055〉0.05）。结论：晶状体外的高钙环境可以诱导晶状体混浊;钙蛋白酶抑制剂E-64d不能抑制晶状体对细胞外钙离子的摄入;钙蛋白酶抑制剂E-64d对高钙诱导的晶状体混浊有保护作用,它可能是直接抑制了钙蛋白酶的活性,进而通过其他途径抑制晶状体蛋白变性或者上皮细胞凋亡及坏死,延缓白内障的发生。

发育期大鼠青霉素点燃后大脑皮质自噬标记蛋白LC-3表达及E-64d干预效应的研究

目的研究发育期大鼠反复惊厥后大脑皮层中自噬标记蛋白LC-3的表达,以及E-64d对其表达的影响。方法生后21 d的SD大鼠随机分成惊厥组、对照组、干预组3组,每组24只。惊厥组大鼠隔日腹腔注射青霉素(4.8×106U/kg),连续6次,诱导惊厥发作;对照组大鼠予同等剂量的生理盐水腹腔注射;干预组大鼠于腹腔注射青霉素诱导惊厥发作前,腹腔注射E-64d(4μg)。惊厥组和干预组大鼠于末次惊厥后3 h、12 h、24 h和出生51 d处死并取其大脑皮质,对照组大鼠也在相应时间点取大脑皮质。采用蛋白质免疫印迹技术(Western-blot)分别检测大鼠大脑皮质中自噬标记蛋白LC-3的表达。结果惊厥组大鼠于末次惊厥后3 h、12 h、24 h大脑皮层LC3II/LC3I较对照组升高,差异有统计学意义(t=2.091～10.353,P均<0.05);干预组与惊厥组大鼠比较,LC3II/LC3I降低,差异有统计学意义(t=2.911～5.980,P均<0.05)。在出生51 d时,三组大鼠间差异无统计学意义(P均>0.05)。结论大鼠惊厥急性期LC-3蛋白明显上调,自噬途径被激活,而E-64d参与了自噬途径的调控。

E-64d对反复惊厥发育期大鼠大脑皮质Beclin-1蛋白表达的影响

目的探讨反复惊厥发育期大鼠大脑皮质中自噬标记蛋白Beclin-1的表达及溶酶体酶抑制剂E-64d对其表达的干预作用。方法将出生21d的SD大鼠随机分成3组,每组24只。惊厥组大鼠隔日腹腔注射青霉素(4.8×106U·kg-1·d-1),连续6次,诱导惊厥发作;对照组大鼠予同等剂量的9g·L-1盐水腹腔注射;E-64d组于每次惊厥前腹腔注射4μLE-64d,采用同样方法腹腔注射青霉素诱导惊厥发作。于末次惊厥后3h、12h、24h和出生51d(P51)处死3组大鼠,并取其大脑皮质,采用免疫印迹技术分别检测3组大鼠大脑皮质中Beclin-1蛋白的表达。应用SPSS16.0软件进行统计学分析。结果惊厥组大鼠3h、12h、24h Beclin-1蛋白的表达均明显高于对照组同一时间点Beclin-1蛋白的表达(Pa<0.05)。E-64d组3h、12h、24h Beclin-1蛋白的表达明显低于惊厥组同一时间点Beclin-1蛋白的表达(Pa<0.05)。3组P51时Beclin-1蛋白表达比较差异均无统计学意义(Pa>0.05)。结论惊厥后急性期Beclin-1蛋白水平明显上调表明自噬途径被激活,且E-64d参与自噬途径的调控。

青霉素点燃发育期惊厥幼鼠脑内丛生蛋白的表达及溶酶体酶抑制剂E-64d对其的干预作用

目的探讨发育期幼鼠反复惊厥后脑内丛生蛋白的表达及溶酶体酶抑制剂E-64 d对其表达的干预作用。方法日龄21 d的SD大鼠随机分为3组:惊厥组(RS组,n=24)、E-64 d干预组(ERS组,n=24)和对照组(CON组,n=19)。于大鼠21日龄开始,RS组大鼠隔日腹腔注射青霉素(5.1×106U.kg-1.d-1),连续6次诱导惊厥发作;ERS组于每次惊厥前腹腔注射4μg E-64 d,采用同样方法腹腔注射青霉素诱导惊厥发作;CON组大鼠予相应剂量的9 g.L-1盐水腹腔注射。于末次惊厥后21 d(出生后51 d),依据Racine标准从RS组及ERS组各随机选取点燃成功的6只大鼠作为本实验的RS组和ERS组。从CON组随机选取6只作为本实验的CON组。处死18只大鼠,并取其大脑海马及皮质,采用免疫印迹技术(Western blot)检测18只大鼠大脑海马、皮质中丛生蛋白的表达。各组蛋白水平应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。结果 RS组大鼠海马及皮质丛生蛋白表达水平均较CON组显著增高,差异均有统计学意义(Pa<0.05)。ERS组海马丛生蛋白的表达低于RS组,差异有统计学意义(P<0.05);ERS组皮质丛生蛋白的表达与RS组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论丛生蛋白参与惊厥性脑损伤的过程,E-64 d的作用可能与其下调丛生蛋白的表达有关。