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重组体pET-28a-alkB/E.coli降解页岩油泥石油烃的功能研究
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作者 李雪菲 句泽林 +3 位作者 齐婷婷 郑乾璐 李喜梅 余丽芸 《山东化工》 CAS 2024年第19期239-243,共5页
为了降解页岩油泥中的石油烃,构建基因工程菌,表达石油烃降解关键酶以提高油泥的降解效果。以Pseudomonas qingdaonensis基因组为模板扩增alkB基因,连接至载体pET-28a,转化至E.coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE和Western-blot鉴定表达的外源... 为了降解页岩油泥中的石油烃,构建基因工程菌,表达石油烃降解关键酶以提高油泥的降解效果。以Pseudomonas qingdaonensis基因组为模板扩增alkB基因,连接至载体pET-28a,转化至E.coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE和Western-blot鉴定表达的外源蛋白。pET-28a-alkB/E.coli处理原油和页岩油泥,采用气相色谱法评估降解效果。发现alkB基因在大肠杆菌中能表达外源蛋白,且14 d原油及页岩油泥的降解率分别为47.5%和47.1%,表明重组体pET-28a-alkB/E.coli具备降解页岩油泥石油烃的功能。 展开更多
关键词 烷烃单加氧酶alkB 生物降解 e.coli BL21(De3) 页岩油污泥 气相色谱法
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基因工程菌E.coli BL21/pET-DsbA-MalQ发酵产麦芽糖转糖基酶的研究 被引量:3
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作者 王水兴 李燕萍 +3 位作者 许杨 夏慧玲 吴凌伟 郁振军 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2007年第8期285-289,共5页
为了获得最佳的基因工程菌E.coli BL21/pET-DsbA-MalQ发酵产酶条件,通过进行诱导时间﹑诱导温度﹑IPTG的浓度﹑诱导前菌液浓度(OD600)等因素梯度实验,研究各因素对发酵产酶的影响。实验结果表明,基因工程菌的最佳诱导条件分别为:诱导时... 为了获得最佳的基因工程菌E.coli BL21/pET-DsbA-MalQ发酵产酶条件,通过进行诱导时间﹑诱导温度﹑IPTG的浓度﹑诱导前菌液浓度(OD600)等因素梯度实验,研究各因素对发酵产酶的影响。实验结果表明,基因工程菌的最佳诱导条件分别为:诱导时间为2.5h,诱导温度为30℃,IPTG浓度为0.5mmol/L,诱导前OD600值为0.5。在最佳工艺条件下,粗酶液的酶活为130U,相当于出发菌产酶效率的135倍。 展开更多
关键词 e.coli BL21/peT-DsbA-MalQ 诱导时间 诱导温度 IPTG浓度 麦芽糖转糖基酶
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内源性血管生成抑制因子Arresten的序列测定及在E.coli BL21中的表达 被引量:1
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作者 唐海英 郑金平 +1 位作者 陈显久 解军 《中国药物与临床》 CAS 2007年第6期410-412,共3页
目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并对其进行序列测定和在E.coli BL21中进行表达。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,对其序列测定后构建重组质粒pBV... 目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并对其进行序列测定和在E.coli BL21中进行表达。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,对其序列测定后构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli BL21进行原核表达。结果成功筛选出Arresten基因,并将基因序列和蛋白序列提交基因库,成功构建了重组质粒pBV220-Arr,重组质粒在菌株中获得表达。结论构建的原核表达重组体pBV220-Arr能高效表达重组Arresten蛋白。 展开更多
关键词 Arresten基因 序列测定 e.coli BL21 基因克隆表达
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TAT-hEGF融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中高效自我表达 被引量:1
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作者 智庆文 苗爱玲 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期89-91,100,共4页
为了获得TAT-hEGF融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达,构建了原核表达载体pRSET-tat-hegf,将其转化E.coliBL21(DE3)得到重组工程菌BL21(DE3)/pRSET-tat-hegf。工程菌在无IPTG的诱导下实现了高效表达,TAT-hEGF融合蛋白的表达量占总菌... 为了获得TAT-hEGF融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达,构建了原核表达载体pRSET-tat-hegf,将其转化E.coliBL21(DE3)得到重组工程菌BL21(DE3)/pRSET-tat-hegf。工程菌在无IPTG的诱导下实现了高效表达,TAT-hEGF融合蛋白的表达量占总菌体蛋白的45.6%,主要以包涵体形式存在。 展开更多
关键词 TAT—heGF融合蛋白 人表皮生长因子 包涵体 e.coli BL21(De3)
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利用小泛素蛋白修饰分子融合技术在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组抗菌肽LLv
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作者 殷文霞 王为栋 +4 位作者 刘晓东 邵坤 单虎 张洪亮 王述柏 《青岛农业大学学报(自然科学版)》 2023年第4期265-269,共5页
为了研究在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中利用小分子泛素蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)融合技术表达重组抗菌肽LLv(antimicrobial peptide LLv)的方法。试验以天然抗菌肽LL-37氨基酸组成及分子结构为依据,人工设计了LLv的氨... 为了研究在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中利用小分子泛素蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)融合技术表达重组抗菌肽LLv(antimicrobial peptide LLv)的方法。试验以天然抗菌肽LL-37氨基酸组成及分子结构为依据,人工设计了LLv的氨基酸序列和基因序列。利用SUMO融合技术,构建重组大肠杆菌表达载体pSUMO-LLv在E.coli BL21(DE3)中表达SUMO-LLv,并研究异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl beta-D-thiogalacyranoside,IPTG)浓度和诱导时间对融合蛋白SUMO-LLv表达的影响,同时分析融合蛋白SUMO-LLv表达的可溶性并分离纯化目的蛋白LLv。结果表明:建立的E.coli BL21(DE3)的pSUMO-LLv重组表达载体,经DNA测序验证构建正确;SUMO-LLv的诱导表达最佳条件是IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导表达时间为2 h;融合蛋白SUMO-LLv主要存在于菌液上清液中,表达含量为11.34μg/mL;免疫印迹试验(Western blot)鉴定证明融合蛋白具有良好的反应原性;采用Ni柱亲和层析法在诱导菌液中成功纯化到了目的蛋白LLv,大小为5 kDa。说明在E.coli BL21(DE3)中利用SUMO融合技术表达重组抗菌肽LLv的方法可行。 展开更多
关键词 LLv SUMO 融合蛋白 诱导表达 e.coli BL21(De3)
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提高碱性磷酸酶在E.coli胞内表达的可溶性及活性 被引量:2
6
作者 杨丹燕 林陈水 《浙江工业大学学报》 CAS 北大核心 2009年第4期372-375,共4页
以E.coliDH5α基因组为模板PCR扩增得到无信号肽的碱性磷酸酶基因片段,与胞内融合表达型T载体连接得到重组质粒,转化表达宿主E.coliBL21(DE3)和E.coliorigami(DE3),经0.1 mM IPTG诱导表达,超声破碎细胞后,SDS-PAGE分析可溶性,融合蛋白在... 以E.coliDH5α基因组为模板PCR扩增得到无信号肽的碱性磷酸酶基因片段,与胞内融合表达型T载体连接得到重组质粒,转化表达宿主E.coliBL21(DE3)和E.coliorigami(DE3),经0.1 mM IPTG诱导表达,超声破碎细胞后,SDS-PAGE分析可溶性,融合蛋白在E.coliorigami(DE3)中的可溶蛋白含量比E.coliBL21(DE3)中高.融合蛋白的可溶部分经Ni2+螯合亲和纯化,纯化后E.coliorigami(DE3)中蛋白活性比E.coliBL21(DE3)中明显提高,达到1 614.3U/mg蛋白. 展开更多
关键词 碱性磷酸酶 e.coli BL21(De3) e.coliorigami(De.) 可溶性 活性
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Prokaryotic Expression of Antimicrobial Peptide CATH PR1–2 from the Skin of Paa robertingeri in Escherichia coli 被引量:3
7
作者 Huaiqing DENG Chen CHEN +1 位作者 Ning XIAO Jiang ZHOU 《Asian Herpetological Research》 SCIE CSCD 2017年第4期275-283,共9页
The aim of this study was to investigate the prokaryotic expression of antimicrobial peptide cathelicidin (CATH) PR1 and PR2 from the skin of Paa robertingeri in Escherichia coli. Two active peptides, CATH PR1 and C... The aim of this study was to investigate the prokaryotic expression of antimicrobial peptide cathelicidin (CATH) PR1 and PR2 from the skin of Paa robertingeri in Escherichia coli. Two active peptides, CATH PR1 and CATH PR2, belong to the CATH family in the skin of P. robertingeri. CATH PR1 has a relatively high antimicrobial activity, especially for the drug-resistant strains found in clinical practice; however, no antimicrobial activity has been found in CATH PR2. The molecular weights of both CATH PR1 and CATH PR2 are relatively low (3195.88 and 2838.34 Da, respectively). Thus, the genetic processes, as well as the expression and purification of these proteins, are difficult to perform. Therefore, in this study, CATH PR1 and CATH PR2 genes were tandem ligated and then connected to the plasmid pET-32a. This reconstructed plasmid was then transfected into the expression vector E. coli BL21 to construct the recombinant expression system. The fusion expression of peptide PR was stable in E. coli after induction with 1.0 mol/L isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside at 37℃ for 4 h. The antimicrobial activity assay using Staphylococcus aureus (Song) and Candida albicans 08030102 showed that the antimicrobial activity of PR was similar to the antimicrobial activity of CATH PR1. This study showed that artificial modification of the amino acid sequences of PR1 and PR2 could result in better protein expression in prokaryotes, and the fusion protein expressed had relatively high antimicrobial and other biological activities. In conclusion, the findings suggest future prospects of the commercialization of this method. 展开更多
关键词 e. coli BL21 fusion expression Paa robertingeri recombinant protein PR
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耐热果胶裂解酶基因pel9A的克隆和表达 被引量:5
8
作者 甄东晓 王树英 +1 位作者 严群 李华钟 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期112-115,共4页
利用PCR技术从耐热梭状芽孢杆菌(Clostridium stercorarium)中扩增得到产耐热果胶裂解酶的结构基因pel9A,并将其克隆于表达载体pET28a中,最后将此重组质粒转化到受体菌E.coliBL-21中进行表达。诱导条件为:37℃诱导5 h,IPTG浓度为0.8 mmo... 利用PCR技术从耐热梭状芽孢杆菌(Clostridium stercorarium)中扩增得到产耐热果胶裂解酶的结构基因pel9A,并将其克隆于表达载体pET28a中,最后将此重组质粒转化到受体菌E.coliBL-21中进行表达。诱导条件为:37℃诱导5 h,IPTG浓度为0.8 mmol/L。重组菌经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表达的蛋白质的相对分子质量为130 000,与预期相对分子质量相符。细胞经超声破碎后,测得果胶酶的比酶活为15 U/mg粗蛋白。 展开更多
关键词 果胶裂解酶 耐热梭状芽孢杆菌 重组质粒 大肠杆菌bl-21 表达
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Clostridium difficile细胞毒素B羧基末端功能区的克隆与表达
9
作者 刘红升 姜泊 +1 位作者 陈村龙 陈学清 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2005年第9期1136-1138,共3页
目的:克隆并表达Clostridiumdifficile(Cdifficile)胞毒素B羧基末端功能区基因,为探索高效的防治Cdifficile感染的疫苗和诊断抗原奠定基础.方法:提取Cdifficile染色体基因,用PCR方法扩增ToxinB3基因,将其克隆至表达载体PET22b(+),用重... 目的:克隆并表达Clostridiumdifficile(Cdifficile)胞毒素B羧基末端功能区基因,为探索高效的防治Cdifficile感染的疫苗和诊断抗原奠定基础.方法:提取Cdifficile染色体基因,用PCR方法扩增ToxinB3基因,将其克隆至表达载体PET22b(+),用重组质粒转化大肠杆菌[E.coliBL21(DE3)],并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析.结果:从Cdifficile基因组DNA中成功地克隆了毒素B的羧基末端重复区域的1848bp基因,经过双酶切、PCR和测序鉴定分析,插入到载体的基因与GenBank中公布的CdifficileVPI10463的ToxinB3基因序列的同源性为99%.SDS-PAGE显示,目的基因表达产物的分子质量为71.3ku,利用表达载体PET22b(+)表达出蛋白质,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34.8%.结论:含CdifficileToxinB3基因的PET22b(+)重组质粒能高效表达目的基因.该重组子的构建为Clostridiumdifficile相关性疾病的诊断及后期制备疫苗,提供了有力的保障. 展开更多
关键词 羧基末端 毒素B 功能区 克隆 le细胞 BL21(De3) e.coli 基因组DNA 基因表达产物 表达载体 大肠杆菌 PAGe PCR方法 相关性疾病 诊断抗原 质粒转化 鉴定分析 基因序列 分子质量 重组蛋白 目的基因 高效表达 重组质粒 3基因
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人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达
10
《第四军医大学学报》 北大核心 2006年第15期1390-1390,共1页
目的:构建人CIDE-3基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法:提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA,经RT—PCR扩增人CIDE-3基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a(+)-CIDE-3... 目的:构建人CIDE-3基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法:提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA,经RT—PCR扩增人CIDE-3基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒pET28a(+)-CIDE-3.经限制性内切酶Bam H I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白. 展开更多
关键词 基因原核表达载体 融合蛋白 BL21(De3) e.coli HepG2细胞 初步 限制性内切酶 PCR扩增 总RNA 瘤细胞系
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小鼠BPI_(36-259)抗菌蛋白在原核细胞中的表达及其抗血清的制备 被引量:8
11
作者 冯颖 李丽 +6 位作者 龙军 范宜强 刘振龙 孔庆利 吕喆 王炜 安云庆 《首都医科大学学报》 CAS 2008年第2期184-189,共6页
目的采用原核表达系统获得小鼠BPI36-259目的抗菌蛋白,免疫家兔制备目的蛋白特异性抗血清。方法利用生物信息学方法预测小鼠BPI功能片段,构建pUC57-muBPI1-281质粒;PCR扩增获得mu BPI36-259基因片段,构建pET28a-mu BPI36-259重组质粒;用... 目的采用原核表达系统获得小鼠BPI36-259目的抗菌蛋白,免疫家兔制备目的蛋白特异性抗血清。方法利用生物信息学方法预测小鼠BPI功能片段,构建pUC57-muBPI1-281质粒;PCR扩增获得mu BPI36-259基因片段,构建pET28a-mu BPI36-259重组质粒;用IPTG诱导重组质粒转化的E.coli BL21(DE3)感受态细胞,获得以包涵体形式表达为主的mu BPI36-259目的蛋白;用变性目的蛋白免疫家兔获得兔抗鼠BPI36-259蛋白特异性抗血清;用间接ELISA法检测血清抗体特异性及其效价。结果成功构建了pET28a-mu BPI36-259重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)获得以包涵体表达形式为主的目的蛋白;用变性目的蛋白免疫家兔获得小鼠BPI36-259蛋白特异性抗血清(效价1∶10000)。结论在原核细胞中成功获得了以包涵体表达形式为主的抗菌蛋白,免疫家兔获得的特异性抗血清可用于小鼠BPI36-259目的抗菌蛋白的检测。 展开更多
关键词 小鼠BPI36-259目的蛋白 e.coli BL21(De3) 多克隆抗血清
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重组细胞色素P450 BM-3突变酶在大肠杆菌中催化吲哚合成靛蓝 被引量:5
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作者 陆燕 梅乐和 +2 位作者 李红梅 盛清 姚善泾 《自然科学进展》 北大核心 2006年第8期1047-1050,共4页
重组细胞色素P450 BM-3突变酶在大肠杆菌(E.coli)BL21得到表达,利用重组菌株细胞催化吲哚合成靛蓝.考察了底物、产物、葡萄糖浓度以及pH值和温度对反应的影响.结果表明: pH 7.0-7.5,温度35℃,底物浓度0.5mmol/L为较好的反应条件... 重组细胞色素P450 BM-3突变酶在大肠杆菌(E.coli)BL21得到表达,利用重组菌株细胞催化吲哚合成靛蓝.考察了底物、产物、葡萄糖浓度以及pH值和温度对反应的影响.结果表明: pH 7.0-7.5,温度35℃,底物浓度0.5mmol/L为较好的反应条件.在此条件下,反应进行8h后,靛蓝产率可以达到29.43%.产物靛蓝对合成反应具有一定的抑制作用,在反应体系中加入5g/L葡萄糖,可以将产率提高到44.08%. 展开更多
关键词 P450 BM-3 e.coli BL21全细胞催化 吲哚靛蓝
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重组大肠杆菌细胞不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯合成(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯 被引量:12
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作者 敬科举 徐志南 +1 位作者 林建平 岑沛霖 《催化学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第11期993-998,共6页
从赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolorZJU0105)中克隆出NADPH依赖型醛基还原酶基因,构建了重组大肠杆菌E.coliBL21(pET28-ALR0105),该工程菌可以高效地表达醛基还原酶.将重组细胞用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原,合成出具有... 从赭色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolorZJU0105)中克隆出NADPH依赖型醛基还原酶基因,构建了重组大肠杆菌E.coliBL21(pET28-ALR0105),该工程菌可以高效地表达醛基还原酶.将重组细胞用于催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原,合成出具有光学活性的(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯.实验发现,在加入适量辅酶及辅酶再生酶的条件下,利用重组细胞催化还原反应可以获得比使用赭色掷孢酵母更高的转化率、产率和ee值,得到了几乎是光学纯的(R)-(+)-型产物,从而解决了酵母细胞催化此类反应ee值较低的问题.考察了辅酶及共底物的添加、底物和产物的浓度、pH值、温度以及菌体密度等因素对还原反应的影响.结果表明,不对称还原反应必须在辅酶NADPH和辅酶再生酶系及共底物葡萄糖的参与下进行;底物和高浓度的产物对还原反应有一定的抑制作用;当pH>6.0时,反应的转化率及产率都显著降低;高密度重组细胞可以减小底物的抑制作用. 展开更多
关键词 重组细胞 大肠杆菌 e.coli BL21(peT28-ALR0105)菌株 醛基还原酶 生物催化 4-氯乙酰乙酸乙酯 不对称还原 (R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯
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耐高温葡萄糖异构酶重组菌发酵与转化条件研究 被引量:2
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作者 贾东旭 周霖 +6 位作者 王腾 於淳安 廖承军 陈德水 王红艳 廖小颖 金利群 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期13-19,共7页
耐高温的葡萄糖异构酶(glucose isomerase,GI)在高温下可将D-葡萄糖异构化为D-果糖,获得的高果糖浆可作为甜味剂应用于食品诸多领域。对Thermus oshimai GI重组菌发酵产酶条件和全细胞转化D-葡萄糖生成D-果糖工艺进行研究。确定诱导温... 耐高温的葡萄糖异构酶(glucose isomerase,GI)在高温下可将D-葡萄糖异构化为D-果糖,获得的高果糖浆可作为甜味剂应用于食品诸多领域。对Thermus oshimai GI重组菌发酵产酶条件和全细胞转化D-葡萄糖生成D-果糖工艺进行研究。确定诱导温度28℃,诱导剂终浓度0.1 mmol/L,发酵培养基添加5 mmol/L Mn^(2+)的最优产酶发酵条件;将最优转化体系放大,包括20 g/L湿菌体、10 mmol/L Mn^(2+)和200 g/L底物,于95℃和pH 7.5条件下生物转化4 h,D-果糖得率高达57.34%。该工艺具备一步法生产F55型高果糖浆的可能性,可简化后续浓缩分离等步骤,为进一步使用食品安全的表达系统生产F55型高果糖浆提供理论依据。 展开更多
关键词 THeRMUS oshimai葡萄糖异构酶 工程菌e.coli BL21(De3)/peT28b/ToGI D-葡萄糖 D-果糖 细胞催化 转化
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重组血管紧张素转化酶抑制肽工程菌细胞破碎条件优化 被引量:1
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作者 李艳 孙海燕 +1 位作者 周丽珍 刘冬 《湖北农业科学》 北大核心 2014年第9期2127-2130,共4页
以重组血管紧张素转化酶抑制肽(ACEIP)工程菌E.coli BL21(pGEX-4T-2-AHP)破碎率、破碎液中目的融合蛋白浓度(GST-AHP)为主要考察指标,对重组血管紧张素抑制肽工程菌破碎条件进行了优化。结果表明,其最佳工艺条件为每克湿菌体重悬... 以重组血管紧张素转化酶抑制肽(ACEIP)工程菌E.coli BL21(pGEX-4T-2-AHP)破碎率、破碎液中目的融合蛋白浓度(GST-AHP)为主要考察指标,对重组血管紧张素抑制肽工程菌破碎条件进行了优化。结果表明,其最佳工艺条件为每克湿菌体重悬于3 mL含有2 mmol/L EDTA的1×PBS缓冲液中,加溶菌酶至终浓度20 000 U/mL,室温放置30 min后超声破碎30 min,4℃10 000 r/min离心10 min取上清液。在此最佳工艺条件下破碎液中可溶性GST-AHP浓度达到1.83 g/L。 展开更多
关键词 重组血管紧张素转化酶抑制肽(ACeIP) 工程菌e coli BL21(pGeX-4T-2-AHP) 破碎条件
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人骨保护素-分枝杆菌热休克蛋白70融合蛋白的克隆与表达及其活性鉴定 被引量:4
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作者 马静 王炜 +3 位作者 赵文明 李慎涛 曾牧 刘振龙 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2008年第15期2903-2909,共7页
目的:为解决类风湿性关节炎中骨破坏及炎症损伤两大难题,拟克隆人骨保护素功能区与分枝杆菌热休克蛋白70肽段融合基因,进一步观察其在大肠杆菌中的表达并鉴定活性。方法:实验于2006-05/2007-09在首都医科大学免疫学系实验室完成。采用... 目的:为解决类风湿性关节炎中骨破坏及炎症损伤两大难题,拟克隆人骨保护素功能区与分枝杆菌热休克蛋白70肽段融合基因,进一步观察其在大肠杆菌中的表达并鉴定活性。方法:实验于2006-05/2007-09在首都医科大学免疫学系实验室完成。采用反转录-聚合酶链反应技术从人骨肉瘤细胞系MG63总RNA中扩增骨保护素成熟肽段编码区基因,构建pGEM-TEasy-骨保护素重组质粒。以此为模板,聚合酶链反应扩增骨保护素-热休克蛋白70功能区DNA,构建重组表达载体pET-28a-骨保护素-热休克蛋白70,将其转化E.coli.BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷诱导后收集菌体蛋白,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白免疫印迹鉴定该融合蛋白的表达,以破骨细胞生长抑制实验及抑炎实验检测该融合蛋白的生物学活性。结果:①实验最终获得人骨保护素全长基因片段,人骨保护素-热休克蛋白70功能区DNA片段已被正确插入到pET-28a载体中,转化菌株可表达人骨保护素-热休克蛋白70融合蛋白。②十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示约在Mr22000处有蛋白的超表达,而未诱导菌株未发现有此条带。③蛋白免疫印迹检测表明,融合蛋白能与抗人骨保护素单克隆抗体特异性结合。④破骨细胞生长抑制实验表明,该融合蛋白能够减少破骨细胞的生成数量,具有体外抑制骨破坏的生物活性。⑤抑炎实验表明,融合蛋白具有显著减轻迟发型超敏反应小鼠模型炎症反应程度的作用,说明融合蛋白中热休克蛋白70具有抑制炎症的生物学活性。结论:在E.coli.BL21(DE3)中表达了骨保护素-热休克蛋白70融合蛋白,体外功能实验证实该融合蛋白具有一定的生物学活性。 展开更多
关键词 e.coli.BL21(De.)中表达了骨保护素-热休克蛋白70融合蛋白 体外功能实验证实该融合蛋白具有一定的生物学活性.
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E.coli O157:H7鞭毛蛋白H7抗原的表达纯化及抗血清的制备
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作者 蔡冉 周洁 +4 位作者 许桂丽 徐悦玥 潘英 李素芹 李越希 《药物生物技术》 CAS 2014年第3期199-203,共5页
应用生物信息学分析工具对E.coli O157∶H7鞭毛蛋白H7抗原(flic基因)表位进行分析,筛选抗原表位较富集的片段;优化基因序列,使其适合在原核载体中表达并化学合成序列。构建重组质粒pGEX-4T-2-flic和pET28a(+)-flic,转化E.coli BL21(DE3)... 应用生物信息学分析工具对E.coli O157∶H7鞭毛蛋白H7抗原(flic基因)表位进行分析,筛选抗原表位较富集的片段;优化基因序列,使其适合在原核载体中表达并化学合成序列。构建重组质粒pGEX-4T-2-flic和pET28a(+)-flic,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,分别用GST胶亲和层析技术和金属螯合层析技术纯化GST标签和His标签的目的蛋白,获得了高纯度的GST-Flic和His-Flic。使用His-Flic抗原免疫新西兰大耳白兔,间接ELISA法检测体液免疫效价,兔颈动脉取血并离心制备获得兔抗血清。纯化的两种蛋白和制备的兔血清多抗为研制E.coli O157∶H7检测试剂奠定了基础。 展开更多
关键词 e.coli O157∶H7 鞭毛蛋白H7抗原 原核载体 e.coli BL21(De3) Flic
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重组大肠杆菌发酵生产二倍体质粒的研究
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作者 许媛佳 凌雪萍 +1 位作者 姚传义 卢英华 《厦门大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期709-713,共5页
随着基因治疗和基因疫苗的发展,急需大量的非病毒载体质粒DNA.主要对重组大肠杆菌E.coliDH5α发酵生产pUC21二倍体质粒的培养基组分和补料分批培养的葡萄糖流加策略进行了研究.初步确定的培养基组分是以葡萄糖作碳源,酵母粉作氮源,并且... 随着基因治疗和基因疫苗的发展,急需大量的非病毒载体质粒DNA.主要对重组大肠杆菌E.coliDH5α发酵生产pUC21二倍体质粒的培养基组分和补料分批培养的葡萄糖流加策略进行了研究.初步确定的培养基组分是以葡萄糖作碳源,酵母粉作氮源,并且添加磷酸盐、硫酸镁、柠檬酸和微量元素.研究发现溶氧反馈流加是比较好的流加葡萄糖的补料策略,它能把葡萄糖浓度控制在较低的水平,从而避免产生乙酸效应.溶氧反馈流加发酵的最大生物量可达30.84g/L,质粒pUC21-Dimer的最大产量达96.38mg/L.该研究为重组大肠杆菌生产二聚体质粒建立了优化工艺,对大规模生产作为基因治疗的多聚体质粒具有指导意义. 展开更多
关键词 e.coli DH5Α pUC21二倍体质粒 培养基组分 流加培养
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小鼠杀菌性或通透性增强蛋白片段BPI_(889-1497)在大肠杆菌的表达及其抗血清的制备
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作者 李堃 刘悦 徐晨 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期964-967,共4页
英国科学家Weiss等1978年首次发现并描述了杀菌性或通透性增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein,BPI)。成熟的BPI蛋白由456个氨基酸组成,相对分子质量(Mr)大约56 000。BPI蛋白最早在人中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒... 英国科学家Weiss等1978年首次发现并描述了杀菌性或通透性增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein,BPI)。成熟的BPI蛋白由456个氨基酸组成,相对分子质量(Mr)大约56 000。BPI蛋白最早在人中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒中分离得到。研究表明,BPI在人中性粒细胞中占较大比重,其含量可以达到细胞总蛋白的0.15%~1.00%, 展开更多
关键词 小鼠BPI889-1497蛋白 e.coli BL21(De3) 多克隆 抗血清
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2种不同方法纯化乳酸杆菌重组S-层融合蛋白的比较试验
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作者 小琴 特尼格尔 +1 位作者 赵慧 格日勒图 《畜牧与饲料科学》 2014年第4期8-10,共3页
将重组菌E.coli BL21(含重组质粒pGEX-SLP)经IPTG诱导获得重组融合蛋白GST-SLP,分别用非特异性的氯化锂沉淀方法和特异性的Pierce GST Spin Purification Kit纯化方法,将该融合蛋白进行纯化,纯化结果采用SDS-PAGE方法进行鉴定。结果显... 将重组菌E.coli BL21(含重组质粒pGEX-SLP)经IPTG诱导获得重组融合蛋白GST-SLP,分别用非特异性的氯化锂沉淀方法和特异性的Pierce GST Spin Purification Kit纯化方法,将该融合蛋白进行纯化,纯化结果采用SDS-PAGE方法进行鉴定。结果显示,2种方法均能够获得大小约为71 ku的目的融合蛋白,但氯化锂沉淀方法纯化效果不及Pierce GST Spin Purification Kit方法。该研究结果为进一步研究乳酸杆菌S-层蛋白生物学特性提供了参考。 展开更多
关键词 重组菌 e.coli BL21 融合蛋白 纯化 鉴定
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