以淀粉酶基因为筛选标记的E.coli克隆载体的构建

以E．coli质粒pJRD184为基础，将多酶切点引入地衣芽胞杆菌（Bacilluslicheniformis）的a－淀粉酶基因信号肽编码区的PstI切点，构建了能表达并将a－淀粉酶（Amy）渗漏到胞外的E．coli克隆载体pLAM9712．该载体可根据在含有可溶性淀粉的LB平板上菌落周围有没有淀粉水解圈直接筛选重组子，从而避免了使用异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）、5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D一半乳糖苷（X－gal），代之以廉价的碘、淀粉．实验进一步验证了pLAM9712在基因克隆中的可行性及质粒本身的稳定性．

细菌的β-1,4一内切葡聚糖酶基因在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达

将大肠杆菌质粒pA2含气单孢菌（Aromonds.sp.212）的β-1，4-内切葡聚糖酶基因直接连干大肠杆菌／酵母菌穿梭载体pVC727组建成重组质粒，质粒PVC含强启动子。首先，通过菌落染色方法和Congo－Red染色方法筛选到大肠杆菌DH5α转化子，然后以重组质粒转化酿酒酵母BJ1991并得到表达。最后，对酶反应的最适pH和适宜温度进行了测定。

人白细胞介素-2突变体在大肠杆菌中的克隆表达与鉴定

根据GenBank报道的人白细胞介素-2(hIL-2)基因分析设计并合成引物,以本室构建的pPIC9K/IL-2突变体(编码125位半胱氨酸→丙氨酸、18位亮氨酸→蛋氨酸、19位亮氨酸→丝氨酸)为模板,PCR扩增出突变型人白细胞介素-2基因.用EcoRI和BamHⅠ对目的基因进行双酶切后,插入大肠杆菌表达载体pBV220,转化宿主菌JM109,经菌落PCR筛选阳性重组子、酶切鉴定,DNA序列分析证实,重组质粒pBV220/IL-2含有突变型人IL-2编码序列及正确的开放阅读框.经42℃热诱导表达,SDS-PAGE电泳显示,诱导表达碎菌后的沉淀中有分子质量大小约为15kD的外源蛋白产生,经Western印迹证明为rhIL-2.成功建立了突变型人白细胞介素-2(rhIL-2)基因的大肠杆菌表达系统,为rhIL-2的生产及临床应用奠定基础.

hFOXP3-Δ E251的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建和表达带HIV-TAT穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的人FOXP3突变体PTD-hFOXP3-Δ E251,为研究人FOXP3的功能奠定基础。方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)总RNA中扩增得到人FOXP3(hFOXP3)的cDNA,然后再利用重叠PCR技术扩增获得hFOXP3-ΔE251基因实变体片段。将该重组突变体插入表达载体pET28a-PTD中,构建表达质粒pET28a-PTD-hFOXP3-ΔE251,然后转化感受态细菌E.coli Rosetta(DE3),最终采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β -D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达。结果:SDS-PAGE电泳分析发现,经0.5mM IPTG诱导8h后,可高效表达重组的融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在。结论:成功制备了带穿膜序列的人FOXP3ΔE251突变体融合蛋白,为更好地研究人FOXP3的功能与特性奠定了实验基础。

小鼠酪氨酸酶的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用逆转录-聚合酶链式反应(RT -PCR)方法,从小鼠黑色素瘤总RNA中扩增得到小鼠酪氨酸酶的cDNA .该基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET - 2 2b(+)中,构建表达质粒pET -TYR并转化大肠杆菌Rosetta (DE3) .SDS -PAGE及蛋白质序列测定表明,经0 .8mmol/L异丙基硫代- β-D -半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组的小鼠酪氨酸酶,表达量约占菌体总蛋白质的2 5 % 。

利用增强型绿色荧光蛋白基因作筛选标记克隆载体的构建及鉴定

目的构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记的新型pUC18筛选载体。方法将EGFP基因克隆至pUC18载体的PstI/HindⅢ位点,构建筛选载体pUC18-EGFP,并验证pUC18-EGFP能否利用EG-FP的荧光特性筛选出含基因重组体的阳性克隆。结果经酶切和基因测序鉴定pUC18-EGFP载体构建正确;在外源基因插入该载体后,对LB氨苄平板上的绿色菌落进行酶切和基因测序鉴定,结果证明LB平板上的绿色菌落即为含有重组质粒的克隆。结论成功构建pUC18-EGFP筛选载体,利用EGFP的绿色荧光可筛选出阳性克隆。