Molecular Characterization of Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH) Gene of Field Isolate of <i>Edwardsiella tarda</i>

The E. tarda bacterial culture isolated from infected fish, was confirmed by morphological and biochemical characterization. GAPDH gene of 996 bp was amplified from bacterial genomic DNA. GAPDH gene was cloned in pTZ57R/T cloning vector. The positive clone was sequenced. The sequencing result showed very homology with published sequence from pathogenic E. tarda. The sequence (nucleotide and amino acid) divergence values were very low between E. tarda isolates from India (KF142190) and China (HQ697337-38) (Figure 4 and Figure 5). However, the divergence value was high when compared with E. tarda isolates from Japan (AB198939) and this value was higher than the inter-specific divergence value (E. tarda-E. ictaluri, E. tarda-E. coli & E. tarda-Klebsiella species).

eha基因调控迟缓爱德华菌抵抗巨噬细胞氧化杀菌作用

目的迟缓爱德华菌(E.tarda)能够在巨噬细胞内生存和繁殖,必须抵抗细胞产生活性氧的杀菌作用。eha基因是该菌一个重要的转录调控基因,本研究探讨eha基因调控E.tarda抵抗巨噬细胞氧化杀菌的机制。方法光镜观察野生株和缺失株分别感染RAW264.7巨噬细胞的过程,及菌落计数法测定细菌胞内存活数目;测定细菌在不同H2O2浓度中的存活率;流式法检测细菌感染巨噬细胞后产生活性氧的细胞比率;qRT-PCR测定细菌超氧化物歧化酶基因sodC和过氧化氢酶基因katB的转录水平。结果 eha基因的缺失,使E.tarda在巨噬细胞内的繁殖速率明显下降(P<0.05),使该菌在不同H2O2浓度中的存活率显著降低(P<0.05),使该菌感染细胞组产生活性氧的细胞比率升高;qRT-PCR结果显示,eha基因的缺失使得该菌的超氧化物歧化酶基因sodC和过氧化氢酶基因katB转录水平下降。结论 eha基因通过调控E.tarda菌分解H2O2相关基因的表达,从而影响该菌分解巨噬细胞中活性氧的能力和在胞内外的存活率。因此,eha基因调控了E.tarda菌抵抗巨噬细胞内氧化杀菌作用,有助于该菌在巨噬细胞内生存和繁殖。

esaC基因对迟缓爱德华氏菌的毒力及T3SS蛋白分泌的影响

为了确定编码迟缓爱德华氏菌(E.tarda)Ⅲ型分泌系统(T3SS)装置蛋白的esaC基因的功能,采用基因敲除的方法构建了E.tarda野生型致病菌株LSFAO的esaC基因无极性缺失突变株LSE40ΔesaC,该突变株缺失了esaC的46-1452bp。Western blotting分析表明,由于esaC的缺失,E.tarda T3SS的输送器蛋白(EseB,EseC,EseD)不能分泌到细胞外,同时细菌的自凝聚现象消失;毒力检测发现,突变株LSE40ΔesaC对蓝曼龙鱼的半数致死量比野生型菌株提高了11.5倍。结果表明,esaC基因影响T3SS输送器蛋白的分泌和E.tarda的毒力。此研究确定了esaC基因作为E.tarda T3SS装置蛋白的功能,加深了对E.tarda致病机理的了解。

基于RNA-seq分析Eha调控迟缓爱德华菌抵抗酸化的作用

目的 Eha是一个影响迟缓爱德华菌(Et)胞内生存的转录调控因子,本研究有助于揭示其调控Et抵御酸的分子机制。方法用ATPase抑制剂洛霉素A1抑制巨噬细胞的酸化,菌落计数法比较酸化对野生株和eha基因缺失株胞内存活数目的影响;比较两种细菌在酸性应激实验中存活率的差异;构建pMP220-P_(eha)LacZ质粒,采用β-半乳糖苷酶实验检测eha基因的启动子在不同酸性pH值下和不同培养时间的转录活性;选择Eha转录水平最高的一个酸性pH值和培养时间,分别提取两种细菌RNA,进行RNA-Sequencing;并用qRT-PCR验证其结果。结果野生株ET13在巨噬细胞内和不同pH酸环境中的存活率明显高于缺失株,阻止酸化胞内菌数明显高于未阻止酸化的胞内菌数(P<0.05)。对数期细菌pH6.3培养基生长2h,RNA-Sequencing结果表明:eha基因缺失株转录水平和野生株相比,147个差异显著表达的基因(DEGs)(|log2Ratio|≥1),其中113个上调,34个基因下调,qRT-PCR随机抽样,和RNA-Sequencing表达趋势呈强相关。147个基因采用GO数据库进行功能聚类,分成25类,主要涉及细菌加工、定位、代谢、结合、催化、运输、细胞成份;基于KEGG通路的富集分析,有130个可以富集到55条通路中,包括与氨基酸、核苷酸、脂质代谢及铁的转运等路径,涉及基因较多的有双组分系统、ABC转运系统、不同环境中的微生物代谢和次级代谢产物等路径。结论在酸性生存环境,Eha对Et的转录组呈多途径、多基因的适应性的全局性调控。

eha基因调控迟缓爱德华菌的毒力

目的 eha基因是E.tarda毒力株ET-13一个重要的转录调控基因,本文研究其对该菌株毒力的影响。方法利用菌落计数法比较野生株和eha缺失株感染小鼠毒力(LD50)的差异,以及比较两菌株在小鼠每个肝脏、脾脏和肾脏中细菌菌落数目的差异;利用组织HE染色观察两菌株对宿主组织损伤的差异;利用RT-PCR,比较两种细菌毒力基因表达的差异。结果 eha缺失株相比野生株其毒力下降了2.5倍;eha缺失株在宿主体内的生存能力明显降低。小鼠感染野生株后,出现肝细胞水肿和中性粒细胞浸润,脾小体内细胞坏死,肾小管水肿等病变,以及上述脏器外观出现改变。提示野生株对小鼠的肝脏、脾脏和肾脏有毒性作用,而eha缺失株对上述脏器无明显毒性作用。RT-PCR结果显示,eha基因的缺失使得E.tarda菌的Ⅲ型分泌系统分泌蛋白基因eseC和外膜蛋白基因(pagC)的转录水平下降,菌毛蛋白基因(fimA)的转录水平没有改变。结论 eha基因缺失后,E.tarda菌ET-13株的毒力因子表达降低,使该菌毒力明显减弱,对宿主的致病性和病理损伤减轻。因此,eha基因是一个毒力正调控基因。

eha基因对迟缓爱德华菌抵抗巨噬细胞内外压力的影响

目的 E.tarda能够在体内外许多环境包括在巨噬细胞内生存和繁殖,eha基因是该菌一个重要的转录调控基因,本研究探讨该基因在细菌抵抗巨噬细胞内外压力中的作用及机制。方法采用体外实验模拟巨噬细胞内氧化和酸杀菌条件、体内血清和胆汁杀菌条件、以及细菌对SDS和多粘菌素B敏感性试验,比较ET-13毒力株及其Δeha缺失株和ehaComp互补株在这些压力下存活率,利用RT-PCR和SDS-PAGE电泳,比较上述3种细菌相关基因的转录和表达的差异。结果eha基因的缺失使ET-13对酸、H2O2、SDS和多粘菌素B敏感性提高(P<0.05);经小鼠血清或鱼胆汁处理后,3种菌株的存活率没有明显区别(P>0.05);RT-PCR结果显示,eha基因的缺失使得E.tarda内的超氧化物歧化酶基因sodC、过氧化氢酶基因katB和鞭毛蛋白基因fliC、Ⅲ型分泌系统分泌蛋白基因eseC的转录水平下降。SDS-PAGE电泳结果显示,缺失株的主要外膜蛋白比野生株表达降低。结论 eha基因通过调控E.tarda相关基因的表达,参与了该菌抵抗巨噬细胞内氧化和酸等的压力,有助于细菌在巨噬细胞内生存和繁殖。

鱼类致病性迟钝爱德华氏菌胶体金快速检测试纸的研制

制备迟钝爱德华氏菌胶体金快速检测试纸并对其性能进行检测。以柠檬酸三钠作为还原剂制备胶体金颗粒,标记迟钝爱德华氏菌多克隆抗体,将羊抗兔IgG和纯化后的迟钝爱德华氏菌多克隆抗体包被于NC膜上作为质控线和检测线,以检测样品中的迟钝爱德华氏菌（E.tarda）。结果表明：所研制的试纸特异性良好,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌等常见细菌或病原菌进行测试未出现交叉反应;敏感度达到105CFU/mL,反应时间仅为5~10 min,可以用于感染迟钝爱德华氏菌大菱鲆腹水的现场检测,具有操作简便、特异性强、灵敏度高等特点。

牙鲆与大菱鲆病原迟钝爱德华氏菌生物学特性及系统发育学分析

对从7起牙鲆(Bastard halibut,Paralichthys olivaceus L.)、3起大菱鲆(Turbot,Scophthalmus maximus L.)病害的病(死)鱼中分离到的相应病原菌较系统地进行了形态特征、理化特性等表观分类学指征的鉴定及代表菌株DNA中G+Cmol%的测定.同时,择代表菌株进行了16S rRNA基因的分子鉴定,测定了16S rRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树.结果表明,分离鉴定的148株菌均为爱德华氏菌属(Edwardsiella Ewing and McWhorter 1965)的迟钝爱德华氏菌(E.tarda),其中128株为迟钝爱德华氏菌野生型(E.tarda wild type)菌株,20株暂定为迟钝爱德华氏菌吲哚阴性变异株.代表菌株(HC010907-1及HC010830-1)的16S rRNA基因序列,与GenBank数据库中的迟钝爱德华氏菌的同源性均在99%.

迟缓爱德华菌外膜蛋白TolC原核表达及其免疫原性

TolC是革兰阴性细菌一种外膜通道蛋白,参与细菌应对外界不利环境的耐受,沙门菌TolC蛋白作为免疫原对动物沙门菌感染的保护效果优良,具有潜在的应用价值。目前,迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)该蛋白的研究尚未见有报道,本研究以E.tarda TolC蛋白作为研究对象,原核表达并纯化TolC蛋白,进一步通过动物试验确定该蛋白具有较强的免疫原性,免疫动物对致病性E.tarda ET-13强毒株感染具有较高的抵抗力。结果表明,E.tarda TolC蛋白具有较强的免疫原性和潜在的疫苗价值,为进一步研制E.tarda亚单位疫苗提供理论资料。