大肠杆菌甲基化缺陷DM1菌株与普通DH5α菌株的感受态转化率的比较

目的观察甲基化缺陷的大肠杆菌DM1菌株与普通DH5α菌株感受态转化效率的差别。方法用常规氯化钙法制备二者的感受态细胞,质粒转化后计算转化率。结果DM1菌株感受态细胞转化率为(2.2±0.3)×106CFU/μg,DH5α菌株感受态细胞转化率为(6.3±0.5)×106CFU/μg。结论成功建立一种高效制备甲基化缺陷菌株DM1感受态细胞的方法,虽然该法制备DM1感受态细胞转化效率比DH5α低2-3倍,但其能够高效满足质粒克隆实验中Dam或Dcm甲基化的限制性位点的使用要求。

抗菌肽天蚕素B突变体ABP-S1基因在E.coli中的融合表达

利用绿色荧光蛋白 (GFP)基因与天蚕素 B突变体 ABP- S1基因的融合基因 ,构建了 2个原核表达载体 p Am GS1和 p Bm GS1,转化表达宿主菌 E.coli BL 2 1(DE3)和 E.coli BL 2 1(DE3) p L ys S。结果 ,p Am GS1未能得到转化子 ,而p Bm GS1的转化子高效表达了融合蛋白 ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检查 ,融合表达产物最高可占菌体总蛋白的49.45 %。表达产物经包涵体复性 ,柱层析初步纯化 ,通过平板抑菌试验 ,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌以及鱼类重要的致病菌嗜水气单胞菌等多种革兰氏阳性。

动物源E.coli O157:H7 stx基因的检测与系统进化分析

为了解2009-2010年间在河南、甘肃地区分离鉴定的5株大肠埃希菌O157(E.coli O157)携带stx的情况及不同分离株间stx分子进化与变迁的情况,本研究利用PCR方法对分离株进行了stx基因检测,并完成了序列测定与系统演化分析。结果表明,5株不同动物源的分离株均含有stx1及stx2基因。序列分析结果显示5株分离株间stx1、stx2的核苷酸及氨基酸同源性均较高;stx1基因均与参考株中的山羊源和食品源E.coli O157菌株的同源性较高,进化树中遗传距离最近;分离株的stx2基因与多株牛源及少数人源参考株也具有较高的同源性,进化树中虽然5株分离菌均在一个大主干分支中,但分离株27与其他各分离株及参照株遗传距离最远,独自处于一次级分支中;分离株L37与W、12与50分别分布于牛源、人源E.coli O157小次级分支中;由此可推测,分离株所携带的stx1很有可能是经食品源或羊源E.coli O157传递而来;分离株L37与W、分离株12与50的stx2可能是由牛源、人源E.coli O157菌株传递而来,分离株27的stx2来源不清楚。研究结果表明,5株E.coli O157分离株均含有stx1、stx2基因,但两个基因的起源存在差异。

MUC2基因表达对益生菌调节肠屏障作用的影响

目的观察益生菌诱导的乳鼠结肠MUC2基因的表达及其对益生菌抑制E.coli K1株E44黏附侵袭肠屏障作用的影响。方法 SD乳鼠分别用益生菌、E44株和益生菌+E44株三组灌胃7 d后,RT-PCR法观察益生菌和E44株诱导结肠MUC2基因的表达;靶向MUC2基因的shRNA真核质粒表达载体(shRNA MUC2)和阴性对照shRNA NC转染人结肠癌Lovo细胞,荧光定量PCR法检测其表达水平,并通过竞争性排斥方法检测MUC2基因对益生菌拮抗致病菌E44粘附侵袭的影响。结果灌胃益生菌组SD乳鼠肠道MUC2基因明显上调,而E44组则显著降低。用shRNA MUC2转染Lovo细胞后,与阴性对照组和空白对照组相比,其表达水平明显降低,干扰率为66.7%;益生菌对E44株粘附侵袭抑制作用明显低于未处理组,与对照组相比,E44相对粘附率为56.64%,相对侵袭率为66.64%。结论益生菌诱导的MUC2基因表达上调可能成为拮抗致病菌易位的保护机制之一;MUC2基因沉默后,益生菌对E44粘附侵袭肠上皮细胞的抑制作用明显降低。

乌梅中化合物V对鸡大肠杆菌的体内和体外杀灭作用研究

通过现代色谱方法应用硅胶、SephadexLH-20凝胶等材料分离了乌梅活性成分;应用波谱方法解析化合物结构,以体外试管倍比稀释法测最小抑菌浓度、体内试验评价防治鸡大肠杆菌病的潜在价值,对乌梅中提取化合物V的抗鸡大肠杆菌活性进行了初步评价。结果表明,以抗大肠杆菌活性为导向,从中药乌梅中分离得到一个单体成分,3-羟基-3-羧基戊二酸二甲酯(化合物V),体外试验显示化合物V的最小抑菌浓度为3.125mg/mL;体内试验显示肉鸡人工感染大肠杆菌后,胶膏、化合物V组、硫酸新霉素组、阴性感染对照组成活率分别为40%,60%,60%和20%;剖检后无菌取肝脏组织培养,以上各测试组大肠杆菌检出率分别为100%,80%,100%和100%。由此得出结论:通过体内、体外试验证明化合物V对肉鸡大肠杆菌病具有一定的预防效果。

水通道蛋白1-C末端肽段/GST融合蛋白的原核表达(简报)

水通道蛋白（Aquaporin，AQP）是一类选择性高效转运水分子的细胞膜通道蛋白，广泛存在于原核和真核生物细胞的细胞膜上．主要介导自由水分子的被动跨膜转运．对保持细胞内外液环境的稳态平衡起着重要的作用。AQP1是第一个被发现鉴定的水通道蛋白．它是1988年Agre等从红细胞膜分离纯化Rh血型多肽时偶然发现的一个分子量为28KD的疏水性跨膜蛋白．称为形成通道整合膜蛋白28（CHIP28）。Agre因此获得了2003年的诺贝尔奖。水通道蛋白AQP1广泛地表达于红细胞、肾、眼、肺，脉络丛和血管内皮，在体液转运中发挥作用。

HIV-1p24蛋白在大肠肝菌中的高效可溶性表达、一步纯化及抗原性分析

合成引物扩增HIV 1p2 4基因 ,并将其克隆到 pQE 30质粒中 ,使其在大肠杆菌E .coliM 15中以IPTG诱导高效表达 ,经SDS PAGE分析 ,该表达产物约占菌体总蛋白 2 0 % ,并且以可溶蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中。经镍离子柱亲和层析一步纯化 ,洗脱产物中 p2 4蛋白纯度达95 %。ELISA分析表明 ,该蛋白可与HIV感染者血清发生特异性免疫反应。以此蛋白交联Sepharose 4B ,亲和层析纯化HIV感染者血清中的抗体 ,用所得抗体与HIV确认试剂反应 ,发现该纯化抗体仅与确认试剂中的 p2 4蛋白反应。上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性HIV 1p2 4蛋白 。

esiRNA分析人源驱动蛋白MKLP1在胞质分裂中的功能

为探讨人源驱动蛋白MKLP1在有丝分裂和胞质分裂中的作用,以E.coliRNaseⅢ制备MKLP1的3′UTResiRNA转染HeLa细胞,通过定量RTPCR、Western印迹检测MKLP1esiRNA对MKLP1基因的沉默效率.再利用FACS分析、免疫荧光染色和活细胞成像分析检测MKLP1表达缺失后在有丝分裂和胞质分裂不同时期的细胞形态学、细胞分裂指数、细胞百分数,动态观察有丝分裂和胞质分裂期间的表型改变,以系统分析MKLP1的功能.最后通过挽救实验验证MKLP1esiRNA的作用特异性.实验显示MKLP1esiRNA转染HeLa细胞能够有效地特异性消除MKLP1的表达,并被异位表达的MKLP1所挽救.MKLP1蛋白在有丝分裂后期和末期前期位于纺锤体中间带,在末期后期和胞质分裂的最后阶段集中于中间体的中心处.MKLP1表达缺失使中间体正确形成和胞质分裂的完成受到严重抑制,造成大量双多核细胞堆积.结果表明,MKLP1在胞质分裂中间体形成和有丝分裂末期前期向后期过渡过程中起关键作用,是纺锤体中间体中间带相关蛋白,为胞质分裂所必需.

产志贺样毒素大肠埃希菌Ⅰ类整合子的鉴定和分析

目的阐明各种来源的产志贺样毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producingE.coli,STEC)中Ⅰ类耐药整合子的分布、特征、所含基因盒的状况以及所表达的耐药信息。方法常规分离出大肠埃希菌、血清学分型,PCR法鉴定产stx1-2毒素性菌株;纸片扩散法对17种抗菌药物进行耐药性监测和分析;PCR法鉴定Ⅰ类整合子阳性株;PCR产物测序并对结果进行分析。结果各种标本中共鉴定出46株产志贺样毒素大肠埃希菌,其中23株为O157∶H7;全部STEC对复方新诺明耐药,对链霉素耐药率为28.3%,氨苄西林为30.4%,而且有5株对至少>4种抗菌药物多重耐药,耐药谱为复方新诺明-链霉素-氨苄西林-庆大霉素;46株分离株中有11株(23.9%)鉴定出Ⅰ类整合子,PCR产物测序得知9株携带aadA1基因盒,2株携带aadA2基因盒,均来自氨基糖苷类抗菌药物耐药菌株(39.3%),传递对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性。结论Ⅰ类整合子存在于各种来源的产志贺样毒素大肠埃希菌中,并携带相应的基因盒,决定着对氨基糖苷类抗菌药物的耐药性。

拟南芥肌醇-1-磷酸合酶类蛋白基因的克隆表达

以野生型拟南芥总RNA为模板,逆转录PCR反应获得拟南芥肌醇-1-磷酸合酶类蛋白基因cDNA(AtMIPS1),开放读码框为1533 bp,编码510个氨基酸.与已报道物种MIPS基因氨基酸序列比较分析表明,AtMIPS1与植物MIPS基因的氨基酸同源性和相似性较高达86%～90%与95%～96%,并含有MIPS基因的保守区域'334SYNHLGNNDG'.将该cDNA序列不改变阅读框架克隆到pET28a(+)原核表达载体上,SDS-PAGE结果表明:在0.12g/L IPTG诱导2 h的条件下得到最佳的蛋白表达效果,AtMIPS1的成功表达为其功能研究打下基础.

污水中大肠埃希菌携带第1类整合子的鉴定和特征分析

目的:探讨污水中大肠埃希菌携带第1类耐药整合子的分布、特征及所含基因盒的种类。方法:常规方法分离大肠埃希菌;纸片扩散法对9种抗生素进行耐药性监测和分析;PCR鉴定1类整合子阳性株;PCR产物测序并对结果进行分析。结果:42份标本中分离出24株大肠埃希菌,为多重耐药菌株,耐药谱为氨苄西林-复方磺胺-红霉素-四环素-链霉素-庆大霉素。有3株(12.5%)鉴定出1.6 kb 1类整合子,PCR产物测序得知携带pse-1-aadA1、pse-1-aadA2、pse-1-aacA1基因盒,传递对β-内酰胺类-氨基糖苷类抗生素的耐药性。结论:1类整合子存在于污水来源的大肠埃希菌中,并携带相应的耐药基因盒,决定着对β-内酰胺类-氨基糖苷类抗生素的耐药性。

升降散对DM大鼠双歧杆菌、大肠杆菌及IL-6的影响

目的:观察升降散对糖尿病大鼠双歧杆菌、大肠杆菌及IL-6的影响,探讨其作用机制。方法:取70只SD雄性大鼠,随机取10只作为正常对照组,余60只用高脂饲料喂养配合小剂量链脲佐菌素诱导建立糖尿病模型,取成模大鼠50只分为模型对照组、拜糖平组、升降散低剂量组、升降散中剂量组和升降散高剂量组,共分6组,每组10只,各组按相应药物剂量干预6周后,每组取8只大鼠样本采用Elisa法检测IL-6、INS,Realtime PCR技术进行细菌定量测定。结果:治疗前,模型对照组、拜糖平组、升降散低、中、高三个剂量组较正常对照组空腹血糖(FBG)、IL-6、INS及大肠杆菌数量均明显升高,但双歧杆菌数量明显减少;治疗前后,正常对照组及模型对照组组内各指标无明显变化。治疗后,拜糖平组及升降散低、中、高剂量FBG在2周、4周及6周均逐渐降低,且高于同时间正常对照组,低于同时间模型对照组(P<0.05);IL-6、INS、大肠杆菌数量较模型对照组明显减少,但同时高于正常对照组(P<0.05);双歧杆菌数量较模型对照组、正常对照组明显增多(P<0.01)。尤以升降散中剂量组增加双歧杆菌数量、降低大肠杆菌数量,抑制炎症因子、降低胰岛素含量效果明显。结论:升降散能通过增加益生菌数量,降低致病菌数量达到调整肠道菌群结构的目的,从而抑制炎症状态,降低血糖。其部分作用机制可能是通过调整肠道菌群、抑制炎症因子而减轻胰岛素抵抗(IR),增加胰岛素利用率实现的。

渗透剂对苹果酸脱氢酶包含体的复性作用

将甜菜碱和海藻糖两种渗透剂作为添加剂,考察了其促进苹果酸脱氢酶包含体的复性作用。结果显示,甜菜碱和海藻糖均可有效促进大肠杆菌苹果酸脱氢酶包含体的复性。在本文实验条件下,随添加甜菜碱浓度的升高,复性后苹果酸脱氢酶的比活增大;而海藻糖则出现最佳添加浓度使复性后苹果酸脱氢酶的比活最大;同时在盐酸胍浓度较高、不添加渗透剂时复性效果较差的复性体系中,若添加合适浓度的甜菜碱或海藻糖即可有效促进苹果酸脱氢酶的复性,显示出渗透剂作为添加剂在实际包含体蛋白质复性过程中的应用前景。另外,通过外源荧光分析发现,添加甜菜碱和海藻糖均可降低苹果酸脱氢酶表面疏水性区域的暴露程度;圆二色光谱分析则表明,甜菜碱和海藻糖可以促进苹果酸脱氢酶α-螺旋结构的生成。

大肠杆菌表达的成骨蛋白-1的复性研究

带有rhOP 1 pBV221 的E.coli表达得到的rhOP 1以不溶的包涵体形式存在,用高浓度的变性剂溶解后,经过DEAE FF纯化,得到高纯度的目的蛋白。利用各种不同方法对蛋白质进行复性,并对复性结果进行比较,发现添加氧化还原剂最有助于二聚体的形成,这是由蛋白质分子的结构和理化性质决定的。

脂微球前列腺素E1与丹参对2型糖尿病患者NO、ET的对比研究

目的:比较2型糖尿病(type 2 Diabetics,T2DM)患者应用脂微球前列腺素E1(Lipo PGE1)和丹参后其血浆一氧化氮(nitric oxide,NO)、内皮素(endothelin,ET)的变化。方法:66例糖尿病患者,按1999年WHO糖尿病诊断标准确认,随机分为两组:Lipo PGE1组和丹参组。两组患者临床检查均无严重心、肾、脑等并发症。ET 1 以放射免疫法测定,NO以硝酸还原法测定。结果:(1)两组T2DM患者的年龄、病程、体重指数(BMI)、收缩压、舒张压、胆固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐、空腹及餐后2h胰岛素、C 肽值均无显著差异。(2)两组T2DM患者用药前空腹及餐后2h血糖无显著差异,治疗2 周后两组空腹及餐后2h血糖亦无显著差异,但均比用降糖药前明显下降,有显著差异。治疗前,PEG1 组无论空腹还是餐后2 hET值均高于丹参组,而NO水平低于丹参组。经2周治疗后,丹参组ET值仅见餐后2 h有显著下降, P<0.05,余未见变化;而PEG1 组不论空腹,还是餐后2hET值均见有极显著下降, P均<0.001,且NO水平也显著升高,P均<0.05。结论:两组T2DM患者在降糖幅度相当的前提下,应用Lipo PGE1在糖尿病患者中能降低ET水平,提高NO浓度,丹参针剂未见相同结果,提示该药物不仅能直接扩张血管作用,而且还能调节ET及NO水平的间接效果,Lipo PGE1明显优于丹参针剂。

培养时间对药敏试验结果的影响

为比较鸡源大肠杆菌培养时间对药敏试验结果的影响,采用12×8型微孔反应板进行2倍稀释法测定鸡源大肠杆菌X1(临床分离敏感菌)、鸡源大肠杆菌C2(临床分离的产β-内酰胺耐药菌株)和大肠埃希氏菌ATCC25922菌株对恩诺沙星、阿莫西林/克拉维酸(4/1)、多西环素和阿米卡星的敏感性。微孔板置于37℃恒温箱中培养,并分别在培养2～22 h各记录一次最小抑菌浓度(MIC)值。结果显示:阿莫西林/克拉维酸、恩诺沙星、阿米卡星和多西环素的MIC值在14～22 h均无变化。当培养时间在4～14 h时,不同药物的MIC值增大幅度不一样,其中阿莫西林/克拉维酸(4/1)和恩诺沙星的MIC值变化不明显,而阿米卡星、多西环素的MIC值变化较大;同时,相同药物对不同菌株的MIC值变化幅度也不一样,其中标准菌株MIC值变化最小,最多不超过8倍,产酶菌株(C2)结果变化较大,最大达到1 024倍,最小8倍。综上所述,临床中进行药敏试验过程中,药物的MIC值随细菌的培养时间延长而增大,当培养时间超过14 h时,其MIC值随细菌的培养时间延长而不再出现明显变化,即在时间有限的情况下,药敏试验至少应培养14 h才能得出较合理的、能正确指导临床用药的MIC值。

基于PM4351的多媒体E1传输电路设计

多媒体数据通过E1电路实时传输的需求日益广泛,但现有的系统多为E1传输设备与多媒体处理设备分离,为此设计了一个以TMS320DM642为主CPU、基于E1芯片PM4351的多媒体数据传输电路。硬件设计中,CPU通过多通道缓冲串口McBSP(Multi-channel Buffered Serial Port)与PM4351芯片相连接,使用总线接口进行数据配置,完成多媒体数据的E1接口传送功能。软件设计包括驱动程序设计、E1数据配置及数据收发。经实验验证,该电路可以使用E1分时隙方式收发数据。

头孢曲松钠治疗大肠杆菌所致疾病机制的研究

目的探讨头孢曲松钠对大肠杆菌(E.coliK1)的作用机制。方法采用对照实验,培养E.coliK1至最佳状态,实验组细菌加入头孢曲松钠100μg,对照组加入生理盐水,孵育1h。通过western-blot方法检测E.coliK1外膜蛋白A的表达变化,软件分析蛋白表达灰度值。结果实验组OmpA与对照组比较,表达量明显下降。结论头孢曲松钠可以诱导E.coliK1的外膜蛋白A表达下降,从而影响E.coliK1外膜的完整性。

产志贺毒素大肠埃希菌中国分离株第1类整合子-基因盒的特征

目的:探讨产志贺毒素大肠埃希菌中国分离株携带第1类整合子的特征及所含基因盒的种类。方法:采用纸片扩散法对8株产志贺毒素大肠埃希菌中国分离株进行抗生素耐药性监测;制备细菌转接合子,采用PCR技术鉴定第1类整合子,并对PCR产物测序及结果分析。结果:4株产志贺毒素大肠埃希菌对复合磺胺、四环素、氨苄西林、环丙沙星表现多重耐药,其中2株同时对链霉素和壮观霉素耐药。PCR检测第1类整合子1000 bp 2株,PCR产物测序1000 bp整合子携带腺苷酰基转移酶(aadA1)基因盒并存在于7800 bp可接合质粒上,与sul 1和qacEΔ1基因连锁,分别传递着对链霉素、壮观霉素、复合磺胺和季胺盐类消毒剂的耐药性。结论:产志贺毒素大肠埃希菌中国分离株可接合质粒上第1类整合子携带的aadA1耐药基因盒是该菌株对氨基糖苷类抗生素耐药产生和扩散的重要原因。

鼠李糖乳杆菌培养上清液通过抑制NF-κB通路预防大肠杆菌性脑膜炎

目的体外探讨鼠李糖乳杆菌上清液(LGG-CM)能否通过抑制NF-κB通路来阻断大肠杆菌K1(E.coli K1)株引起的细菌性脑膜炎。方法用人脑微血管内皮细胞(HBMEC)构建体外血脑屏障模型;采用免疫印迹研究LGG-CM能否抑制E.coli K1激活NF-κB通路;通过侵袭实验和中性粒细胞迁移实验,研究LGG-CM能否抑制细菌侵袭和中性粒细胞迁移;通过免疫印迹研究黏附分子CD44和紧密连接蛋白ZO-1的表达;免疫荧光检测ZO-1蛋白的细胞内分布;用Transwell建立体外血脑屏障模型,通过跨细胞内皮电阻(TEER)值和细菌迁移实验评价LGG-CM对细胞屏障完整性的保护作用。结果免疫印迹结果表明LGGCM能抑制E.coli K1激活NF-κB通路,藉此抑制E.coli K1的侵袭和中性粒细胞迁移。同时,LGG-CM可抑制E.coli K1上调CD44蛋白和下调紧密连接蛋白ZO-1。此外,LGG-CM能够明显减缓TEER值的降低和抑制E.coli K1穿越体外血脑屏障。结论体外实验表明,LGG-CM能够通过抑制NF-κB通路激活、阻断E.coli K1侵袭和中性粒细胞迁移及维护血脑屏障完整性来预防E.coli K1引起的细菌性脑炎。