大肠杆菌K1株对人脑微血管内皮细胞的侵袭及侵袭基因功能分析

[目的]研究大肠杆菌侵袭相关基因在侵袭过程中的作用和相互关系[方法]将大肠杆菌侵袭基因缺失突变株俩两混合侵袭人脑微血管内皮细胞(HBMEC)并计算各混合组的相对侵袭率。应用基因转染技术将脑内皮细胞侵袭基因B(ibeB)基因导入HBMEC获得稳定转染的细胞克隆,再利用化学荧光免疫荧光技术检测ibeB基因转染的HBMEC细胞骨架与细胞间紧密连接的变化。[结果]各混合组的相对侵袭率显著不同分别为100%、76%、44%,前两组数据之间(P=0.36)无显著差异,前两组与后一组数据之间(P<0.01)且两组细菌的组合对HBMEC的侵袭具有明显的协同作用;ibeB基因转染的HBMEC细胞骨架与细胞间紧密连接都发生了变化。[结论]ibeB基因转染HBMEC的确可以使HBMEC形态改变,说明ibeB基因的产物是细胞骨架和紧密连接的调节蛋白。

头孢曲松钠治疗大肠杆菌所致疾病机制的研究

目的探讨头孢曲松钠对大肠杆菌(E.coliK1)的作用机制。方法采用对照实验,培养E.coliK1至最佳状态,实验组细菌加入头孢曲松钠100μg,对照组加入生理盐水,孵育1h。通过western-blot方法检测E.coliK1外膜蛋白A的表达变化,软件分析蛋白表达灰度值。结果实验组OmpA与对照组比较,表达量明显下降。结论头孢曲松钠可以诱导E.coliK1的外膜蛋白A表达下降,从而影响E.coliK1外膜的完整性。

Muc2基因沉默可降低益生菌抑制大肠杆菌黏附和侵袭的能力

目的建立抑制肠上皮细胞基因组中Muc2基因表达的CRISPR/Cas9系统并探索粘蛋白Muc2在鼠李糖乳杆菌GG株（LGG）抑制大肠杆菌K1（Escherichia coli,E.coli k1）株E44黏附和侵袭肠上皮中的作用机制。方法设计2个长20～25 bp的sg RNA分别靶向Muc2,合成sg RNA寡核苷酸序列并构建CRISPR表达载体,转染野生型人结肠癌Ht29细胞,蛋白免疫印迹法检测抑制效率及通过MTT法检测其细胞活力及生长情况后,竞争性排斥分析验证粘蛋白Muc2在益生菌抑制E44黏附侵袭肠上皮中的作用。结果目的sg RNA寡核苷酸双链成功插入酶切后的lenticrisprv2质粒载体中且序列正确;稳定抑制Muc2表达的细胞株筛选成功;Muc2基因沉默后,与空白对照组相比,其表达水平明显降低,抑制率可达81%（P〈0.01）;黏附侵袭实验中E44相对黏附率为72.23%（P〈0.01）,相对侵袭率为81.49%（P〈0.01）,益生菌LGG的抑制E44黏附和侵袭作用明显下调。结论Muc2基因下调明显降低益生菌抑制E44黏附和侵袭肠上皮细胞的能力,提示益生菌刺激Muc2表达上调可能是其强化加固肠粘膜屏障和拮抗致病菌功能的关键性机制之一,并可为肠道细菌性感染疾病的预防治疗提供了一个新手段。