表达猪瘟病毒E0-E2基因重组腺病毒疫苗在兔体上的免疫原性分析

研究表达猪瘟病毒E0-E2基因重组腺病毒疫苗(rAd-E0-E2)在兔体上的免疫原性,并确定其最小免疫保护剂量。将rAd-E0-E2按10倍梯度稀释为107.0 IFU、106.0 IFU、105.0 IFU,分别免疫接种家兔,14d后,用猪瘟脾淋苗对各组兔子进行攻毒。结果107.0 IFU组和猪瘟脾淋苗组均未出现定型热反应(0/4),脾重/体重指数比值分别为0.055%、0.05%,脾组织切片均未见充血、淤血,用RT-PCR和IFA方法均未检测到脾脏内有猪瘟脾淋苗病毒;106.0 IFU组3/4出现定型热反应,脾重/体重指数比值为0.074%,脾组织切片3/4可见充血、淤血,用RT-PCR和IFA方法可检测到3/4脾脏有猪瘟脾淋苗病毒;105.0 IFU组和对照组全部出现定型热反应(4/4),脾重/体重指数比值分别为0.099%和0.102%,脾组织切片充血、淤血严重,用RT-PCR和IFA方法均可检测到兔子脾脏内有猪瘟脾淋苗病毒。结果表明与对照组均不保护和猪瘟脾淋苗组全部保护相比,rAd-E0-E2在兔体的最小免疫保护剂量为107.0 IFU,本研究成功完成了rAd-E0-E2在兔体上的免疫原性分析。

表达猪瘟病毒E0-E2蛋白的重组腺病毒疫苗免疫效力研究

为研究重组猪瘟腺病毒活载体疫苗(rAd-E0-E2株)对猪的免疫保护效力,并确定其最小免疫剂量及免疫期,本研究将40头健康仔猪随机分为8组,每组5头,1~5组为最小免疫剂量测试组,分别接种rAd-E0-E2株活疫苗1/20头份、1/10头份、1/2头份、1头份(1.58×107.0IFU),另设生理盐水对照组。于免疫后7 d、14 d收集血清,采用ELISA方法检测猪瘟病毒抗体,免疫后14 d攻毒;6~8组为免疫期组,分别接种1头份的rAd-E0-E2株活疫苗和1头份的猪瘟活疫苗(脾淋源,C株),于免疫后7 d、14 d、21 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d、210 d收集血清,采用ELISA方法检测猪瘟病毒抗体,免疫后7个月攻毒。所有试验组猪攻毒后监测体温变化,观察猪瘟临床症状和剖检病变。最小免疫剂量检测结果显示,1/20头份剂量组攻毒后1/5保护,4/5出现高热稽留、典型CSF症状和剖检病变;1/10头份、1/2头份和1头份剂量组攻毒后均5/5保护,体温无明显变化,无猪瘟临床症状和剖检病变。免疫期结果显示,免疫组攻毒后均为5/5保护,且r Ad-E0-E2株免疫后7个月抗体水平高于C株,阴性对照组猪攻毒后均发病。综上所述,疫苗的最小免疫剂量为1/10头份(1.58×106.0IFU),考虑到临床实际应用影响因素较多,为确保免疫效果,将疫苗的使用剂量定为最小免疫剂量的10倍,即1头份。r Ad-E0-E2株活疫苗免疫猪1头份后免疫期至少为7个月。本研究为r Ad-E0-E2株后续应用提供了参考依据。

表达猪瘟病毒E0-E2基因重组腺病毒疫苗在小鼠体内的存留时间分析

研究E0-E2基因和表达蛋白及抗体水平在小鼠体内的最长存留时间,以确定表达猪瘟病毒E0-E2基因重组腺病毒疫苗(rAd-E0-E2)在小鼠体内的存留规律。本试验选用30只SPF级别的健康小鼠,随机分为A、B组,各免疫组以1×106 IFU/只剂量接种rAd-E0-E2,对照组注射生理盐水。A组20只于接种后不同特定时间(2只/次)采集血液和组织进行PCR和IFA检测E0-E2基因及表达蛋白残留情况;B组10只于接种后1、3、5、7、10、14、21、28d采集血清检测猪瘟抗体水平。PCR和IFA检测显示,在接种12、24、36h后肝、脾、肾组织和血清中E0-E2基因和蛋白检出率为100%,接种48h后小鼠肝、脾组织检出率为50%,肾组织和血清检出率为100%。接种72h以后,小鼠血液和组织检测均为阴性。接种后7d试验组体内抗体阳性率为40%,接种后10d小鼠体内抗体阳性率为100%,抗体阻断率在43%～51.2%,接种后28d,猪瘟抗体阳性率为100%,抗体阻断率在75.6%～87.5%。表明rAd-E0-E2在小鼠体内的存留时间最长72h,接种时间与E2抗体水平呈正相关。

猪瘟病毒E0和E2蛋白融合表达的重组腺病毒构建及免疫保护性研究

为评价重组腺病毒融合表达猪瘟病毒(CSFV)E0和E2蛋白的免疫保护效果,本研究以CSFV基因组为模板,应用RT-PCR扩增E0和E2蛋白的编码基因,通过pET-32a载体将E0和E2基因串联,形成pET-E0-E2重组质粒。用KpnⅠ和NotⅠ双酶切pET-E0-E2得到E0-E2融合基因,定向亚克隆于穿梭载体pAdTrack-CMV中,采用"两步转化法"在细菌内同源重组,构建携带E0-E2基因的重组腺病毒转移载体质粒pAdEasy-E0-E2,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚胎肾细胞(HEK293),成功包装出重组腺病毒(rAd-E0-E2),PCR和western blot检测表明,E0-E2基因已重组于腺病毒基因组中并获得表达。将rAd-E0-E2接种于小鼠和猪,并通过ELISA进行抗体检测。另外,将rAd-E0-E2经肌肉2次(间隔7d)免疫接种6周龄～7周龄猪,3周后用103TCID50CSFV石门株攻毒。结果表明,rAd-E0-E2免疫组6/7头存活,各组织器官带毒时间不超过10d,而非重组腺病毒rAd-CMV免疫组和空白对照组全部死亡,各组织器官均能分离到CSFV。结果提示,rAd-E0-E2能使免疫猪抵抗CSFV强毒攻击,为进一步研制猪瘟基因工程疫苗提供了实验依据。

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E_0-E_2融合基因的构建及其在卡介苗中的表达

为提高牛病毒性腹泻-黏膜病病毒基因工程疫苗的免疫效力,运用重叠延伸PCR法将E0、E2截短基因进行融合后亚克隆至PMV361载体上,重组质粒经酶切和PCR鉴定后电转化入BCG中。构建的重组卡介苗经45℃热诱导2 h后,进行SDS-PAGE分析和Western blotting检测。结果表明:E0-E2融合基因在卡介苗中获得了表达,目的蛋白大小为66.5 kD,且具有反应原性。该重组卡介苗的构建为牛病毒性腹泻-黏膜病和结核病的防制奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒E_0-E_2融合基因重组卡介苗的构建

为了增强重组卡介苗对牛病毒性腹泻黏膜病的免疫效果,本研究将敲除疏水氨基酸及密码子优化的E0基因与去除了C末端的疏水序列E2截短基因采用重叠延伸PCR的方法进行融合后,将其分别与p MV261/p MV361载体连接,电转化至卡介苗中,构建重组卡介苗。45℃热诱导重组卡介苗表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果证明E0-E2融合基因在卡介苗中成功表达,目的蛋白大小为66.5 ku,且具有反应原性。

黑龙江省部分地区进口荷斯坦奶牛病毒性腹泻血清流行病学调查

为了解黑龙江省进口荷斯坦奶牛感染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的情况,试验采用原核表达蛋白E0-E2为抗原,建立间接ELISA法,检测奶牛血清中BVDV的抗体。结果表明:九三地区的BVDV抗体阳性率最高,达到了72.22%;密山地区阳性率最低,但也达到了59.91%;北安地区阳性率为61.84%,总体血清阳性率为64.35%。说明病毒性腹泻在黑龙江省存在非常高的血清阳性率,提示必须加强对本病的检疫净化,采用间接ELISA法对不同牛群进行BVDV抗体检测,可以及时了解病毒性腹泻的感染清况,为防治该病提供理论依据。