E2F6在物理性低氧及化学性低氧诱导的凋亡中的表达特征(英文)

心肌细胞凋亡性死亡是低氧发生时的重要病理学特征,但低氧诱导的心肌细胞凋亡的调控机制尚未完全阐明。E2F6是E2F转录因子家族成员之一, 我们新近的研究证实其具有抑制DNA损伤诱导的细胞凋亡作用。但是,E2F6 是否参与了低氧诱导的心肌细胞凋亡的调控尚不清楚。在本研究中,我们初步探讨了E2F6 在物理性低氧及化学性低氧模拟物诱导大鼠心肌细胞系H9c2 细胞凋亡中的表达特征。结果表明:物理性低氧、化学性低氧模拟物去铁胺(desferrioxamine, DFO)和氯化钴(cobaltchloride, CoCl2)均能有效诱导 H9c2 细胞发生凋亡。在物理性低氧及 CoCl2 诱导的 H9c2 细胞凋亡中,内源性 E2F6 mRNA 表达明显下调,但蛋白表达没有明显变化。而在DFO 诱导的凋亡中,内源性E2F6 mRNA及蛋白表达均发生明显下调。这些结果提示,E2F6 可能参与调控DFO 模拟低氧诱导的H9c2 细胞凋亡,而对物理性低氧及CoCl2 模拟低氧诱导的细胞凋亡敏感性较低。此外,DFO 模拟低氧诱导的细胞凋亡机制可能与物理性低氧及 CoCl2 模拟低氧诱导的细胞凋亡机制不同。

miR-185通过调控E2F6抑制肺鳞癌细胞增殖和侵袭

目的探讨微小RNA-185(micro RNA-185,miR-185)对肺鳞癌细胞增殖和侵袭能力的作用及其可能的作用机制。方法人肺鳞癌细胞系(NCI-H520、NCI-H226)以及正常肺上皮细胞(BEAS-2B)为实验用细胞;q RT-PCR检测miR-185表达量;miR-NC(对照)和miR-185 mimics(miR-185类似物)利用Turbofect进行转染;Western blot检测E2F6的蛋白表达量;双荧光素酶报告基因检测miR-185与E2F6的靶向调控关系;MTT检测细胞的增殖能力;细胞侵袭试剂盒检测细胞的侵袭能力;构建pc DNA.3.1-E2F6重组载体,并转染肺鳞癌细胞过表达E2F6。结果 miR-185表达量在肺鳞癌细胞中显著降低(P<0.01)。miR-185靶向抑制E2F6基因(P<0.05)。转染miR-185 mimics显著上调miR-185的细胞含量(P<0.01)并抑制E2F6蛋白表达(P<0.01),肺鳞癌细胞增殖能力(P<0.05或P<0.01)和侵袭能力(P<0.05)亦显著受抑。转染pc DNA.3.1-E2F6到miR-185含量升高的细胞,E2F6蛋白表达量显著升高(P<0.01)且细胞增殖(P<0.01)和侵袭能力(P<0.05)上升。结论 miR-185可以通过靶向E2F6抑制肺鳞癌细胞增殖和侵袭。

过表达E2F6基因抑制BRD7基因启动子活性

BRD7基因是采用cDNA代表性差异分析法克隆的一个新bromodomain基因(GenBank登录号AF152604).它在鼻咽癌细胞和组织中表达明显下调,过表达BRD7基因可抑制鼻咽癌细胞的生长和细胞周期的进程.前期工作已克隆了BRD7基因启动子区,并将其启动子定位于450bp(-404～+46bp)的区域.为了进一步揭示BRD7基因在鼻咽癌细胞和组织中表达下调的分子机制,生物信息学分析表明,BRD7基因启动子-229至-243bp为一个E2F6转录因子结合位点共有序列,电泳迁移率实验结果表明转录因子E2F6特异性地结合于BRD7启动子区.荧光素酶检测和绿色荧光蛋白表达检测都证实,过表达E2F6基因能抑制BRD7基因启动子活性.

肺鳞癌中E2F1、E2F6及TPX2的表达及临床意义

目的探究E2F1、E2F6及Xklp2靶蛋白(TPX2)在肺鳞癌中的表达情况及临床意义。方法选取2019年2月至2020年10月于本院收治进行手术的肺鳞癌患者58例。取肺鳞癌组织作为研究样本,取癌旁正常组织作为对照样本。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测E2F1、E2F6、TPX2的相对表达量,卡方检验分析E2F1、E2F6、TPX2表达与肺鳞癌患者临床病理特征的关系,Pearson法分析肺鳞癌组织中E2F1、E2F6、TPX2相对表达量间的相关性。结果肺鳞癌组织中E2F1、E2F6、TPX2表达水平均明显上调(P<0.05);肺鳞癌组织E2F1的表达与患者年龄、性别、肿瘤直径、临床分期、吸烟史无关(P>0.05),与淋巴转移、肿瘤分化程度有关(P<0.05);E2F6的表达与患者年龄、性别、吸烟史无关(P>0.05),与肿瘤直径、淋巴转移、临床分期、肿瘤分化程度有关(P<0.05);TPX2的表达与患者年龄、性别、肿瘤直径、吸烟史无关(P>0.05),与淋巴转移、临床分期、肿瘤分化程度有关(P<0.05);E2F1、E2F6、TPX2表达水平间相互正相关(P<0.05)。结论肺鳞癌组织中E2F1、E2F6、TPX2的表达均明显上调,彼此关系密切,均与淋巴转移、肿瘤分化程度有关,可能共同参与肺鳞癌发生发展过程。

HIF-1α和E2F6蛋白在宫颈鳞状细胞癌中的表达及其意义

目的探讨HIF-1α和E2F6蛋白与宫颈鳞状细胞癌侵袭、转移的关系。方法采用免疫组化SP法,检测40例正常宫颈黏膜上皮、40例宫颈上皮内肿瘤(CIN)及40例宫颈鳞癌患者组织中HIF-1α和E2F6蛋白的表达,分析其与各临床病理参数之间的关系及二者的相关性。结果在正常宫颈黏膜上皮、CIN及宫颈鳞癌组织中,HIF-1α的阳性表达强度呈递增趋势,且差异显著(P<0.05),E2F6的阳性表达强度呈递减趋势,且差异显著(P<0.05);宫颈鳞癌组织中E2F6和HIF-1α的表达呈负相关关系(Tb=-0.51,P<0.05)。结论 HIF-1α的高表达及E2F6的低表达可能与宫颈鳞癌的发生、发展、浸润及转移有关,二者的负相关关系为进一步研究宫颈鳞癌的发生、发展机制提供依据。

miR-561通过调控E2F6蛋白表达对神经干细胞增殖和分化作用机制研究

目的探讨微小RNA(miR)-561调控E2F6蛋白表达对神经干细胞增殖和分化的影响及其可能的作用机制。方法采用实时荧光定量PCR技术(qPCR)检测E2F6蛋白在胎鼠中的表达水平;分化病毒感染后的神经干细胞,采用荧光免疫染色和qPCR检测E2F6蛋白过表达对神经干细胞分化的影响。结果E2F6蛋白在胎鼠大脑各个区域和其他器官中的表达量明显不同,其中大脑区域,E2F6蛋白在海马和小脑两个区域的表达量相对较高,而在中脑表达量最低;E2F6蛋白可促进神经干细胞向少突胶质细胞分化。结论通过对miR-561调控E2F6蛋白表达对神经干细胞增殖和分化的影响及其作用机制的研究,可能有效改善肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化症等相关疾病水平。

皮肤E2F6蛋白表达水平与糖尿病周围神经病变患者预后的相关性研究

目的:探讨皮肤E2F6蛋白表达水平与糖尿病周围神经病变(DPN)患者病情的相关性。方法:纳入2型糖尿病(DM)患者160例,根据有无周围神经病变分为无病变DM组和DPN组,各80例。健康人80例纳入对照组。比较各组外周血空腹血糖(FBS)、糖化血红蛋白(GHb)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、胰岛素、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)及皮肤组织E2F6蛋白表达。结果:无病变DM组及DPN组的FBS、GHb、空腹胰岛素、TG和TC水平明显高于对照组(均P<0.05)。DPN组GHb、空腹胰岛素、TG、TC水平高于对照组(均P<0.05),无病变DM组及DPN组FBS差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比,无病变DM组、DPN组SOD、GSH-PX和E2F6蛋白水平较低,MDA水平较高,差异有统计学意义(P<0.05);与无病变DM组比,DPN组SOD、GSH-PX和E2F6蛋白水平较低,MDA水平较高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:E2F6蛋白水平的降低可能与DPN的发生发展有关。

核转录因子E2F6通过β联蛋白信号通路调控恶性黑素瘤细胞增殖和转移的机制研究

目的研究核转录因子E2F6在人恶性黑素瘤组织和细胞系中的表达,及其对恶性黑素瘤细胞A375增殖、迁移和侵袭的影响。方法收集重庆市中医院2012年1月至2017年12月皮肤科确诊的50例皮肤恶性黑素瘤和30例色素痣冻存组织及石蜡切片。通过qRT-PCR分析E2F6 mRNA在人恶性黑素瘤和色素痣组织及7株恶性黑素瘤细胞系(HM、A375、WM451、WM35、SK-MEL-1、Hs-695T、MDA-MB-435s)和色素痣细胞中的表达,免疫组化和Western印迹检测E2F6、β联蛋白在人恶性黑素瘤组织中的表达。采用脂质体转染法将E2F6抑制质粒和对照质粒转染至A375细胞,通过qRT-PCR和Western印迹验证E2F6基因的敲减效率。通过CCK8、软琼脂平板克隆实验、Transwell迁移和侵袭实验、3D细胞培养实验检测E2F6基因敲减对A375细胞增殖、迁移和侵袭的影响,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率,通过Western印迹检测总β联蛋白、活化β联蛋白、c-Myc和细胞周期蛋白D1等水平。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验;采用Pearson相关系数分析皮肤恶性黑素瘤中E2F6和β联蛋白表达的相关性。结果7株恶性黑素瘤细胞系E2F6 mRNA相对表达水平均高于色素痣细胞(均P<0.001)。qRT-PCR显示,皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6 mRNA的相对表达(0.00055±0.00017)高于色素痣组织(0.00018±0.00009,t=3.22,P<0.001)。免疫组化、Western印迹显示,皮肤恶性黑素瘤组织中E2F6的相对表达水平高于色素痣组织(均P<0.001),而β联蛋白的相对表达水平低于色素痣组(均P<0.001)。相关性分析显示,恶性黑素瘤组织中E2F6蛋白与β联蛋白的表达呈负相关(免疫组化:r=-0.56,Western印迹:r=-0.63,均P<0.01)。敲减A375细胞E2F6基因后,E2F6抑制组E2F6 mRNA、蛋白相对水平低于对照组(t=3.38、2.76,P<0.001)。CCK-8实验显示,继续培养后48 h,E2F6抑制组细胞增殖能力低于对照组(t=4.58,P<0.01);软琼脂平板实验显示,E2F6抑制组细胞相对克隆比低于对照组(t=2.26,P<0.001);迁移实验显示,E2F6抑制组穿出小室细胞数(165±23)低于对照组(376±22,t=3.14,P<0.01);侵袭实验显示,E2F6抑制组穿出小室细胞数(96±11)低于对照组(315±31,t=2.12,P<0.01);3D细胞培养实验显示,E2F6抑制组细胞形态发生明显变化,侵袭性伪足消失。流式细胞仪检测显示,E2F6抑制组G0-G1期细胞比例、细胞凋亡率均高于对照组(均P<0.001)。Western印迹显示,E2F6抑制组β联蛋白水平、活化β联蛋白水平及其下游靶基因蛋白c-Myc、细胞周期蛋白D1水平均低于对照组(P<0.001),P21蛋白水平高于对照组(P<0.001);E2F6抑制组上皮-间质转化相关分子波形蛋白、神经钙黏着蛋白水平低于对照组(P<0.001),而上皮钙黏着蛋白水平高于对照组(P<0.001)。结论核转录因子E2F6在恶性黑素瘤中高表达,敲减A375细胞E2F6基因可能通过拮抗β联蛋白信号抑制细胞增殖、迁移和侵袭。

E2F6基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建含E2F6基因的重组pFLAGCMV10质粒并进行鉴定。方法以人全血细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出E2F6基因。将PCR产物克隆进真核载体pFLAGC-MV10内,构建含E2F6基因的重组真核表达质粒。重组质粒转染293T细胞,用Western blot方法检测E2F6在293T细胞中的表达。结果核酸序列分析的结果表明,克隆的E2F6基因与GenBank中已登记的E2F6基因序列100%同源。Western blot结果显示,在约35-kD位置有目的条带,与预期的重组E2F6蛋白大小一致。结论 成功构建了含E2F6基因的真核表达质粒。

基质细胞衍生因子1预处理抑制大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡

背景:研究发现基质细胞衍生因子1除参与趋化干细胞定向迁移途径,还具有抗凋亡作用。目的:观察基质细胞衍生因子1预处理后对骨髓间充质干细胞凋亡的影响。方法:以不同浓度H2O2诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡,取最适宜浓度100μmol/L用于实验。不同质量浓度基质细胞衍生因子1干预100μmol/L H2O2诱导后的大鼠骨髓间充质干细胞,选择0.2mg/L最佳保护质量浓度用于实验。取第3代大鼠骨髓间充质干细胞,随机分组:正常对照组不进行任何处理;损伤组在培养液中加入H2O2作用24h;基质细胞衍生因子1预处理组于H2O2损伤细胞前6h加入基质细胞衍生因子1;基质细胞衍生因子1+AMD3100(基质细胞衍生因子1受体CXCR4的阻断剂)组于H2O2细胞损伤前6h加入基质细胞衍生因子1与AMD3100共孵。结果与结论:H2O2能体外模拟缺血缺氧环境诱导骨髓间充质干细胞凋亡,且作用呈剂量依赖性。与损伤组比较,加入基质细胞衍生因子1预处理后细胞凋亡明显减轻(P<0.01),细胞E2F6基因表达增强(P<0.05),E2F1基因表达减少(P<0.05),线粒体细胞色素C转位减少(P<0.05),Caspase-3活性降低(P<0.05),AMD3100可阻断基质细胞衍生因子1对骨髓间充质干细胞的保护作用。提示基质细胞衍生因子1可能通过增强E2F6基因,负性调控E2F1基因抑制线粒体损伤导致的骨髓间充质干细胞凋亡。