犬2型腺病毒E3区缺失性表达载体的构建及外源基因表达

为构建可用于同源重组或体外重组的犬腺病毒 (canim e adenovirus,CAV) E3区缺失性表达载体 ,在克隆的 E3区两末端设计并合成了 2对突变引物 ,在引物中分别引入 1个 Bgl 酶切位点 ,以 p BE3质粒为模板 ,经 2次点突变后 ,得到含有 2个 Bgl 位点的重组质粒 p BE3M。该质粒经 Bgl 酶切后自连得到 E3区缺失的质粒 p BE3Δ。在 p BE3Δ质粒的 Bgl 位点加入接头后 ,产生含多个酶切位点的质粒 p BE3L,经相应的酶切鉴定 ,证明突变、缺失和接头连接正确后 ,利用 p BE3L 分别构建了带有和不带有外源性启动子的绿色荧光蛋白基因的重组表达质粒 ,并分别进行转染以检测其表达。结果显示 ,p BE3L CGFP质粒在转染 DK细胞后 ,于 36 h即可观察到荧光 ,72～ 96 h无明显差别 ,传 3代后仍可见表达荧光的细胞 ;而 p BE3L GFP质粒转染 DK细胞后经检测无表达。结果表明 ,构建的 E3区缺失性载体不能利用 E3区自身的启动子进行目的基因的表达 ,外源性启动子的加入是必要的。

鹅源腺病毒基因组E3区的鉴定和分析

在构建鹅源腺病毒Y81G4株Hind文库的基础上,通过特定的引物采用PCR方法从腺病毒文库的A片段中扩增并序列分析鉴定了腺病毒的E3区。E3区二端分别是保守性较强的pⅧ基因和纤维蛋白基因。和人腺病毒E3区相比,鹅源腺病毒E3区具有以下二个显著特征:(1)长度较短,全长仅为238个核苷酸;(2)E3区不具有明显的编码框。本研究也进一步证实了此鹅源腺病毒应归类于Ⅲ型禽腺病毒。

犬2型腺病毒E3区的克隆及其缺失改造

为构建可用于插入外源基因的犬 2型腺病毒 (CAV - 2 )E3区表达载体 ,用KpnI对CAV - 2DNA进行酶切 ,回收含E3区的KpnIB片段并将其克隆到质粒pBluescriptIIKS(+)中 ,获得了正向和反向插入的重组质粒 ,并对E3区进行了序列测定。根据E3区两末端的序列合成了两对突变引物 ,每对引物分别在E3区的 2 4 986bp及 2 6 36 0bp处各引入一个BglⅡ酶切位点。以E3区正向插入的重组质粒pBE3- 2为模板 ,分别用两对突变引物经PCR法连续进行两次点突变 ,通过BglII酶切 ,最终筛选到在E3区的首尾两端各引入一个BglII酶切位点的突变重组质粒pBEM。利用BglII酶切将E3区切除约 1 4kb的片段 ,然后在缺失部位插入了人工接头 ,接头设计了 5个单一酶切位点 ,得到的pBE3L质粒可用于外源基因的插入。

Ⅱ型犬腺病毒C株E1、E3区克隆测序及E3区标记载体瞬时表达

设计4对引物,对犬Ⅱ型腺病毒2C(CAV-2C)株E1、E3区进行了扩增,将片段进行T克隆、测序,并构建了E3区缺失、标记EGFP的转移载体,在MDCK和293-T细胞上成功表达,但在MDCK细胞中的转染效率较低。本研究为犬腺病毒活病毒载体构建的研究提供基础。

腺病毒4型E3区核苷酸序列测定及其基因结构与功能分析

本文将Ａｄ４基因组相当于７３．３—８９．２基因图谱单位（ｍ．Ｕ．）则的ＤＮＡ片段进行了序列测定及基因结构分析，它包括了Ａｄ４Ｅ３区全基因及该区两侧的部分序列。序列分析表明，Ａｄ４Ｅ３区从ＴＡＴＡＡｂｏｘ起至该区基因结束共４７７８ｂｐ，编码１１个大于６ｋＤ的开放读码框架（ＯＲＦ）。对Ａｄ４Ｅ３区ＯＲＦ分析结果表明，Ａｄ４Ｅ３区编码的１９．３ｋ、１５ｋ和１０．４ｋ蛋白，分别与Ａｄ２Ｅ３区的ｇｐ１９ｋ、１４．７ｋ和１０．４ｋ蛋白相对应，具有非常相似的结构。Ａｄ４Ｅ３区全基因组ＤＮＡ与Ａｄ２和Ａｄ３Ｅ３区ＤＮＡ具有较高的核苷酸同源性，分别为５０％—５５％和５５％—６０％，这一数值大大超过了Ａｄ４全基因组ＤＮＡ与其他亚属的同源性（４％—２３％）。从以上分析可以看出，尽管腺病毒Ｅ３区为非必需区，但在不同型别的腺病毒中都保留着这一区域，而且具有相似的基因结构特征和较高的同源性，说明Ｅ３区在腺病毒自然感染中发挥重要作用。

犬腺病毒Ⅰ型疫苗株DNAE3区序列分析

对犬腺病毒Ⅰ型（CAV－Ⅰ）疫苗株CLL（CannughtLaboratoryLimited）DNA的E3区，pVⅢ基因和部分fiber基因进行序列测定，E3区为病毒DNA复制非必需区，因而本实验结果对构建CLLE3缺失表达载体具有重要指导意义。

E3泛素连接酶1对SOX2蛋白稳定性的影响

目的探讨WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1(WWP1)和E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)对3种转录因子[八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定区Y-box蛋白2(SOX2)和NANOG蛋白]水平的影响。方法通过质粒转染,在HEK 293FT细胞中分别共表达OCT4、SOX2、NANOG和WWP1或WWP2。通过免疫印迹法检测WWP1或WWP2过表达对OCT4、SOX2、NANOG蛋白水平的影响。通过GST pull-down实验和免疫共沉淀实验分析WWP1与SOX2蛋白间的相互作用;运用体外蛋白质泛素化修饰实验证明WWP1是否为SOX2的特异E3泛素连接酶。结果在WWP1与OCT4、WWP1与SOX2及WWP2与OCT4共表达体系中,WWP1或WWP2均呈剂量依赖性地下调对应的共表达蛋白OCT4或SOX2水平,且以WWP1与SOX2共表达体系中SOX2蛋白的表达下调最为明显。在其他共表达体系中,WWP1或WWP2对对应的共表达蛋白均无明显的下调作用。溶酶体抑制剂氯喹可部分阻止SOX2蛋白水平的降低。放线菌酮(CHX)处理24 h后,WWP1与SOX2共表达体系中的SOX2蛋白水平的下降速度快于单独过表达SOX2(P<0.05)。WWP1可以通过与SOX2蛋白的直接相互作用催化SOX2蛋白的泛素化修饰。结论WWP1是SOX2蛋白新的E3泛素连接酶,可促进SOX2蛋白经泛素-溶酶体途径降解,进而下调SOX2蛋白的表达。

犬2型腺病毒通用载体的构建及鉴定

为了获得能够携带较大外源基因的犬2型腺病毒E3区缺失性载体,以犬2型腺病毒全基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2及E3区重组质粒pVAX-E3为基础,缺失1381bp的E3区片段(92.6%的E3区全序列),插入Linker-NF(内含NotⅠ、ClaⅠ、FseⅠ多克隆位点),获得重组载体质粒pPolyⅡ-CAV-2-ΔE3(NF)(31.9kb)。以AscⅠ和PmeⅠ双酶切,游离重组基因组,在脂质体LipofectamineTM2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3区缺失的重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)。通过病毒的形态学观察,血凝性、生长特性、感染性实验证明,该重组病毒与母源病毒没有差异。重组病毒CAV-2-ΔE3(NF)可以作为载体表达外源基因,其外源基因插入片段不小于3.3kb。

一种改进的简单快速的多位点突变方法

为了在 1个基因序列内同时实现多个位点突变 ,本试验以犬 2型腺病毒 E3区为突变目的基因 ,建立了一种以多个引物多聚酶链式反应为基础的简单快速的多位点突变方法。首先根据需要在 E3区不同位置设计了与同一条链互补的 4条突变引物 ,在 4条引物 (PBGL、PNCO、PBST、PNOT)中分别引入了 Bgl 、Nco 、Bst B 和 Not 位点 ,与模板链核苷酸序列相比 ,每条引物内均包含了 2～ 3个突变的碱基 ;然后以含 CAV- 2 E3区基因的质粒为模板 ,利用高保真 DNA聚合酶、d NTPs和 5′末端磷酸化的 4条引物 ,在同一个 PCR反应管内进行突变 PCR反应 ,最后以 Dpn 消化反应管内模板链 ,取少许电激转化 E.coli DH10 B感受态细胞获得转化子。经上述 4种内切酶对转化子 DNA的酶切鉴定 ,证明获得了存在多种突变组合的突变基因 ,为进一步研究 E3区不同缺失对外源基因表达的影响奠定了基础 。

CBL通过泛素化降解NCK2抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭

目的阐明Casitas B系淋巴瘤(CBL)蛋白对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响并探讨其作用机制。方法乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF7常规培养,实验分为NC组、过表达CBL组和siNC组、siCBL组,采用克隆形成法和细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、伤口愈合实验、Transwell实验检测过表达(沉默)CBL对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;流式细胞术和Western blot验证CBL对乳腺癌细胞周期进程、细胞周期标志物和上皮-间充质转化(EMT)的影响;罗丹明标记的鬼笔环肽染色细胞骨架观察CBL对细胞丝状伪足数量的影响。采用IP-质谱法筛选CBL的相互作用蛋白并确定NCK2为研究对象。实验分为CBL组、NCK2组、CBL+NCK2组,通过免疫共沉淀(IP)和免疫荧光共定位实验验证CBL与NCK2蛋白互作情况。通过环己酰亚胺追踪实验和泛素化实验检测CBL对NCK2蛋白稳定性和泛素化的影响。采用CCK-8和Transwell实验检测NCK2对CBL介导的乳腺癌细胞增殖及迁移能力的影响。结果过表达CBL组的细胞增殖、迁移、侵袭能力显著降低(P<0.05);沉默CBL组的细胞增殖、迁移、侵袭能力显著增加(P<0.01)。沉默CBL促进MCF7细胞周期G1/S转换(P<0.05)。过表达CBL下调乳腺癌细胞周期相关蛋白CDK2/4(P<0.01)、Cyclin A2/B1/D1/D3/E2(P<0.05)、EMT相关蛋白Snail、N-Cadherin、Claudin-1(P<0.05),同时上调E-Cadherin(P<0.05);沉默CBL上调乳腺癌细胞周期相关蛋白CDK2/4/6(P<0.05)、Cyclin A2/B1/D1/D3/E2(P<0.05),EMT相关蛋白Snail、Vimentin、Claudin-1(P<0.05),同时下调E-Cadherin(P<0.05)。过表达CBL使乳腺癌细胞系MDA-MB-231中丝状伪足数量减少;沉默CBL使乳腺癌细胞系MCF7中丝状伪足数量增加。NCK2与CBL相互作用。过表达CBL抑制NCK2蛋白稳定性(P<0.05),并促进其泛素降解(P<0.01)。过表达NCK2能够逆转CBL介导的乳腺癌细胞增殖和迁移的抑制作用(P<0.01)。结论CBL可通过泛素化降解NCK2抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。