采用EF-1α序列分析法对苜蓿根腐病病原菌——锐顶镰刀菌的鉴定

苜蓿根腐病对苜蓿生长和产量造成严重影响,为了解引起根腐病病原真菌的种类,本文对从陕西省定边县牧草草场紫花苜蓿根部分离得到的根腐病病原菌进行形态学观察、EF-1α序列分析鉴定及接种试验。结果表明:通过对病原菌在PDA培养基中的分离、纯化得到的单菌落形态学观察及显微镜下菌丝、孢子的观察,该病原菌属于引起苜蓿根腐病的镰刀菌属(Fusarium);用CTAB法提取病原菌基因组DNA,并对EF-1α序列进行PCR扩增、回收纯化、克隆测序,将测序结果进行Blast比对,构建系统发育树,分析与Genbank已知近缘种属亲缘关系,结果显示与锐顶镰刀菌(F.acuminatum)亲缘关系最近,可信度达99%;最后通过根部接种试验,接种苜蓿根部发病症状与田间根腐病发病症状一致,鉴定结果显示本试验研究的引起紫花苜蓿根腐病的病原菌为镰刀菌属锐顶镰刀菌(F.acuminatum)。

玉米顶腐镰孢菌rDNA-ITS和EF-1a基因序列及UP-PCR遗传多样性分析

对采自辽宁省部分地区的45份玉米顶腐病病株进行分离培养,共获得89株镰孢菌,采用传统形态学分类和现代分子生物学方法,共鉴定出4个种,分别为:亚粘团镰孢菌(Fusarium subglutinans)、轮枝镰孢菌(F.verticillioides)、层生镰孢菌(F.proliferatum)和尖孢镰孢菌(F.oxysporum)。经EF-1a基因序列建立系统发育树,将顶腐镰孢菌分为4个组。用5条通用引物经UP-PCR扩增后,扩增出57条谱带,其中多态性条带53条,占总条带数的93.0%。遗传多样性分析表明,当相似系数0.626时,可将24个菌株划分为4个组,EF-1a基因序列与UP-PCR和ITS序列相比,更能体现镰孢菌种间和种内的亲缘关系及遗传差异性。

基于COⅡ和EF-1α基因部分序列的中国蝶类科间系统发生关系

为了探讨中国蝶类科间系统发生关系,本文对细胞色素氧化酶Ⅱ(COⅡ)的部分序列(620bp)和延伸因子基因(EF-1α)部分序列(595bp)进行了分析(共1215bp)。其中有464个变异位点,330个简约信息位点。COⅡ基因部分序列表现出明显的A+T含量(76.3%)偏高。分别采用最大简约法(Maximum Parsimony,MP)、最大似然法(Maximum Likelihood,ML)和贝叶斯推论法(Bayesian Inference,BI)重建了分子系统树。结果表明:弄蝶科、凤蝶科、粉蝶科、灰蝶科能够单独成一支,其中弄蝶科位于系统树的基部,分化较早,是较原始的类群,与传统的形态分类结果是相一致的;粉蝶科与凤蝶科的亲缘关系较近;蚬蝶科倾向与灰蝶科有较近的亲缘关系,且蚬蝶科种群始终聚为一支,显示了该科是一个单系群,从单系性方面来看,本文支持将蚬蝶科作为一个独立的科;此外,本文结果表明,中国分布的蛱蝶总科是一单系群,并且它与灰蝶科和蚬蝶科聚成的一支是姐妹群关系。

中国黄粉蝶亚科六属间基于COⅡ和EF-1α基因部分序列的系统发育关系(鳞翅目:粉蝶科)

为了探讨中国黄粉蝶亚科属间的系统发育关系,我们对其中6属9种的细胞色素氧化酶Ⅱ(COⅡ)的部分序列和延伸因子基因(EF-1α)部分序列进行了分析。分别采用最大简约法(maximum parsimony,MP)、最大似然法(maximum likelihood,ML)和贝叶斯推论法(bayesian inference,BI)构建黄粉蝶亚科分子系统树。结果表明:在测得的COⅡ基因的648bp序列和EF-1α基因的504bp序列中,有261个变异位点,151个简约信息位点,黄粉蝶亚科内各属COⅡ基因A+T含量(77.3%)均明显偏高。系统发育分析显示黄粉蝶属为亚科中较为原始的类群,分化较早,豆粉蝶属和迁粉蝶属亲缘关系较近,但钩粉蝶属与豆粉蝶属、迁粉蝶属之间的亲缘关系还不能确定。本研究结果和传统的基于形态学的黄粉蝶亚科的分类体系有所不同,最显著的分歧是本研究支持内群中分化最早的属应为黄粉蝶属,而不是豆粉蝶属和迁粉蝶属。

建鲤内参基因EF-1α的实时荧光定量PCR方法的建立

真核生物延伸因子基因(EF-1α)在蛋白质翻译过程中起着重要的作用,其序列具有高度的保守性,常作为内参基因应用于real time PCR中。通过RT-PCR克隆出建鲤(Cyprinus carpio var.jian)EF-1α的部分cDNA序列,其长度为425 bp,翻译成140个氨基酸,Blast结果显示与其它鱼类leptin的相似性为98%。同时也克隆出建鲤EF-1α相应的DNA序列,共506 bp。cDNA和DNA的序列比对显示克隆出的建鲤EF-1α含有1个相位为0的内含子,在此基础上设计一对跨越内含子的引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了real time PCR方法。以肝脏cDNA为标准品,建立了标准曲线,并进行了融解曲线分析。结果表明,所建立的方法具有特异性强、相关系数高、线性范围广等优点,可应用于建鲤的功能基因表达研究。

奥利亚罗非鱼EF-1α基因的克隆与结构分析

真核生物延伸生长因子基因(EF-1α)在蛋白质翻译过程中起着重要的作用,其序列具有高度的保守性,是一种管家基因。本文通过RT-PCR克隆出奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)EF-1α的部分cDNA序列,其长度为425bp,翻译成141个氨基酸,计算的蛋白质分子量为15.1ku。同源性分析显示,奥利亚罗非鱼EF-1α氨基酸序列与尼罗罗非鱼(O.niloticus)的相似性最高,为100%;与青(鱼将)(Oryzias latipes)、欧洲鲈(Dicentrarchus labrax)、斑马鱼(Danio rerio)、鲑鱼(Salmo trutta)的相似性分别为92%、91%、85%、82%;与小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、人(Homo sapiens)、鸡(Gallus gallus)的相似性均为85%。同时克隆出奥利亚罗非鱼EF-1α相应的DNA序列,共506bp。cDNA与DNA的序列比对显示克隆出的奥利亚罗非鱼EF-1α含有1个内含子,这为将来设计EF-1α荧光定量引物以及测定其在不同组织中的表达量变化打下基础。

中华绒螯蟹延伸因子EF-1δ基因全长cDNA克隆及表达

根据非洲爪蟾延伸因子-1δ(elongation factor-1δ,EF-1δ)基因的保守序列设计引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆出中华绒螯蟹EF-1δ基因并进行各组织间的表达分析。序列分析表明,中华绒螯蟹EF-1δcDNA全长933 bp,编码263个氨基酸,经BLASTN和BLASTX软件分析表明,此EF-1δcDNA核苷酸序列与非洲爪蟾EF-1δ核苷酸序列的同源性最高,其相似性为70%;所编码的氨基酸序列与大红斑蝶EF-1δ的氨基酸序列相似性为54%。聚类分析表明,中华绒螯蟹EF-1δ的氨基酸序列与鱼虱EF-1δ聚为一支。荧光定量PCR结果显示,EF-1δ在正常成熟中华绒螯蟹肌肉中表达量最高,精巢、肝胰腺中有少量表达,心脏、卵巢、胃、肠、鳃中有微量表达。不同发育状态的中华绒螯蟹EF-1δ在肌肉组织中表达量均显著高于肝胰腺和鳃组织中表达量(P<0.05);3个不同发育状态蟹EF-1δ在肌肉中的表达量也呈显著性差异(P<0.05),在早熟蟹肌肉中表达量最高,正常成熟蟹肌肉中次之,幼蟹肌肉中最低;不同发育状态蟹EF-1δ在肝胰腺和鳃组织中的表达没有显著差异(P>0.05)。

基于COI和EF-1α基因的绢粉蝶属和妹粉蝶属系统发育关系分析

【目的】由于绢粉蝶属Aporia和妹粉蝶属Mesapia的分类地位尚存在争议,本研究基于COI和EF-1α基因探讨它们的系统发育关系。【方法】对采自中国的19个种(含绢粉蝶属13个种,妹粉蝶属1种以及用作外群的另外3个属的5个种)的COI和EF-1α基因部分序列进行了测定和分析;依据这2个基因的联合序列采用最大似然法(maximum likelihood,ML)和贝叶斯法(Bayesian inference,BI)构建了这些种的系统发育树。【结果】序列分析结果显示,测得的COI序列长度为657 bp,EF-1α序列长度为642 bp,联合后获得的序列总长为1 299 bp,其中变异位点439个,简约信息位点249个;序列A+T的含量明显高于C+G的含量。系统发生分析结果显示,除外群外,其余种类形成单系群(BV=100,PP=1.00),且分成两大支,一支为(奥倍绢粉蝶A.oberthuri+锯纹绢粉A.goutellei)+(丫纹绢粉蝶A.delavayi+(完善绢粉蝶A.agathon+(马丁绢粉蝶A.martineti+(大翅绢粉蝶A.largeteaui+巨翅绢粉蝶A.gigantea)))),另一支为普通绢粉蝶A.genestieri+(中亚绢粉蝶A.leucodice+((绢粉蝶A.crataegi+灰翅绢粉蝶A.potanini)+(妹粉蝶M.peloria+(暗色绢粉蝶A.bieti+小檗绢粉蝶A.hippia))))。【结论】本研究结果支持妹粉蝶属应为绢粉蝶属的异名,且绢粉蝶属内不再划分亚属和种组。

当归延伸因子AsEF-1β基因的克隆及胁迫应答分析

延伸因子1β(EF-1β)是蛋白质生物合成过程中肽链延长必需的调节因子之一。该研究采用同源克隆和RACE扩增技术克隆当归EF-1β基因序列,分析该基因序列特征、蛋白结构特点及UV-B辐射胁迫下的组织响应表达,以揭示当归栽培生境变迁过程中对UV-B胁迫适应的分子机制。结果显示:(1)成功克隆获得当归EF-1β基因全长序列(950 bp),编码225个氨基酸,命名为AsEF-1β(GenBank登录号:MG736314);AsEF-1β蛋白的分子量为24.5 kD,理论等电点为4.48,属亲水性氨基酸,在其C末端具有一个EF-1B超蛋白家族的典型结构域和保守区,鸟嘌呤核苷酸交换结构域;其氨基酸序列与同为伞形科的胡萝卜氨基酸序列相似性最高,达93%。(2)qRT-PCR分析结果显示,AsEF-1β基因在当归根部的表达量显著高于茎和叶(P<0.05);UV-B辐射胁迫下,茎及叶中的表达量均上调,分别是自然光照处理的2.43和3.76倍。研究表明,AsEF-1β基因可能参与当归对UV-B辐射胁迫的适应过程,为深入研究其在药用植物生长发育、逆境抗性形成及药效物质的生物合成代谢过程的生态调控奠定了基础。

基于核基因EF-1a序列的盾蚧亚科7个属的系统发育

【目的】对盾蚧亚科昆虫的基因序列进行研究,探讨EF-1a基因在该亚科昆虫中的分子进化机制,为我国盾蚧亚科昆虫的分类与鉴定提供理论依据。【方法】以EF-1a为目的基因,对分布于中国的盾蚧亚科雪盾蚧属、白轮蚧属、并盾蚧属、盾蚧属、矢尖蚧属、拟轮蚧属和围盾蚧属7个属13种蚧虫以及2个外群的EF-1a基因进行特异性扩增和测序。使用ClustalX1.83和MEGA4.0系统发育分析软件,对所得DNA序列的碱基组成、碱基替换、遗传距离等进行分析;通过碱基替换饱和性分析进行了信号检验;在MEGA4.0软件中采用最大简约法、邻接法和最小进化法对盾蚧亚科7属的系统发育关系进行分析。【结果】(1)盾蚧亚科7属的EF-1a序列中,T、C、A、G的平均含量分别为23.5%,25.6%,25.5%和25.4%,A+T的含量为49%,G+C的含量为51%。(2)转换频率是颠换频率的1.3倍,转换主要发生在A与G之间,颠换主要发生在A与T之间。(3)碱基替换饱和性分析显示,EF-1a数据集有较强的系统发育信号。系统发育树的结果显示,白轮蚧属、并盾蚧属和雪盾蚧属属同一支,盾蚧属和矢尖蚧属属同一支,围盾蚧属和拟轮蚧属属同一支。【结论】EF-1a基因是盾蚧亚科属级分类单元分子系统发育的有效基因标记之一。

果蝇EF-1α蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为进一步研究延长因子-1(elongation factor-1α,EF-1α)在调控心脏发育和果蝇心脏功能中发挥的作用,制备延长因子-1的抗体.利用生物信息学选择果蝇EF-1α基因抗原亲水区,并设计出特异性引物,PCR扩增出的片段克隆到原核表达pET-28a载体中,转入E.coli中后通过IPTG诱导融合蛋白表达,将His-EF-1α融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,再用Western Blot检测抗体的效价和特异性.研究结果表明,获得了EF-1α原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗EF-1α多克隆抗体.EF-1α多克隆抗体的效价可以达到1比1500,并且有很强的特异性,为后续研究EF-1α基因在心脏发育和心脏功能中的作用奠定了基础.

基于核基因EF-1α的中国境内东方蜜蜂遗传分化

对中国境内19个地区的东方蜜蜂的EF-1α基因进行了测序,并结合蜜蜂属内其他蜂种以及其他地区东方蜜蜂的相应序列信息,分析中国境内东方蜜蜂的遗传分化状况.测序后得到了中国境内19个不同地区的EF-1α部分序列,将获得基因序列提交至GenBank,登录号为：KF663 570～KF663 573.通过对19个地区的东方蜜蜂EF-1α基因序列比对后发现,这些序列间的相似性均大于99.3%,序列中共有3个变异位点.基于EF-1α构建的系统发育树显示19个地区的东方蜜蜂与印度尼西亚、斯里兰卡和马来西亚的东方蜜蜂,以及沙巴蜂和绿努蜂聚为一个分支.研究的结果表明,该基因不能够用于东方蜜蜂的种内分化研究,但作为蜜蜂种间的系统发育研究确是一种很好的分子标记.

偃松内参基因PpEF-1α的生物信息学分析

【目的】寻找偃松种子萌发过程的内参基因,为研究偃松种子萌发过程提供必要的分子生物学基础,丰富偃松基因资源。【方法】利用偃松种子萌发RNA-Seq数据和Genbank数据库对比筛选偃松EF-1α基因,通过生物信息网站及软件对其进行生物信息学分析。【结果】得到一条偃松EF-1α基因,命名为PpEF-1α。该基因具有完整的开放读码框(ORF),ORF长1344 bp,编码447个氨基酸,其氨基酸序列与挪威云杉EF-1α氨基酸序列(GenBankID:CAC27139.1)相似度最高,可达97.46%。PpEF-1α基因存在一个PTZ00141超家族位点。该基因编码的蛋白为亲水性稳定蛋白,具有α螺旋、延伸链以及无规则卷曲二级结构。根据实验室前期转录组分析结果显示,PpEF-1α基因在此过程中稳定表达。【结论】找到偃松种子萌发过程中的一个内参基因PpEF-1α,但其表达趋势有待于进一步的实验验证。

东北地区玉米茎腐病镰孢菌EF-1α基因序列分析鉴定

从东北地区采集玉米茎腐病标样90份,经分离纯化获得镰孢菌120株,在传统形态学鉴定的基础上,选取21株具有代表性菌株,采用基因组DNA的EF-1α序列分析技术进行镰孢菌种类的辅助鉴定。结果表明,引起玉米茎腐病的主要致病菌有4种,分别是轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、胶孢镰孢菌(Fusarium subglutinans)和层生镰孢菌(Fusarium proliferatum),分离频率分别为45.45%、36.36%、15.15%、3.03%。

基于Histone H3、EF-1α和β-tubulin基因部分序列的芒果畸形病菌鉴定与系统发育研究

芒果畸形病是芒果生产中重要的病害之一,主要表现为花畸形和芽畸形,受害果园常因畸形花絮无法挂果而造成减产,我国攀西地区的部分果园株发病率高达100%,给当地的芒果产业带来严重经济损失。该病自1891年首次在印度发现后,陆续在世界芒果产区发生危害。

基于ITS基因、Actin基因和EF-1α基因序列的新疆向日葵黑茎病菌亲缘关系分析

对不同地理来源的向日葵黑茎病菌的ITS基因、Actin基因和EF基因进行测序,结合GenBank中的同源序列,对这3种基因的序列进行比对分析和系统进化分析,探讨ITS、Actin以及EF基因用于向日葵黑茎病菌的种内鉴定以及其系统进化的可行性。结果表明:ITS序列和Actin序列比较保守,无法作为种内鉴定的依据。EF基因序列其变异几率比较高,不同地理来源的菌株在EF-1α基因序列上表现出了比较大的差异,可以用于种内亲缘关系的研究。

LETM1对骨肉瘤细胞恶性生物学行为的作用及其机制

目的 探讨亮氨酸拉链-EF-hand跨膜蛋白1(LETM1)对人骨肉瘤MG63及143B细胞增殖、迁移、凋亡、成骨分化及体内成瘤的作用及其机制。方法 将骨肉瘤MG63及143B细胞分为空白对照组(未加入腺病毒感染)、阴性对照组(sh-NC组,用RNAi阴性对照病毒感染)及LETM1敲低组(sh-LETM1组,用sh-LETM1腺病毒感染)。采用Western blotting检测各组LETM1蛋白在健康人成骨细胞hFOB1.19及骨肉瘤细胞中的表达水平,以验证腺病毒敲低效果;细胞克隆形成实验及CCK-8法检测细胞增殖情况;划痕愈合实验及Transwell实验检测细胞迁移情况;DAPI染色法及Annexin V-APC/7-AAD流式细胞术双染法检测细胞凋亡情况;碱性磷酸酶(ALP)染色及茜素红S染色检测细胞的早期及晚期成骨分化情况。将10只裸鼠分为sh-NC组(n=5,以RNAi阴性对照病毒感染的143B细胞注入裸鼠皮下)与sh-LETM1组(n=5,以sh-LETM1腺病毒感染的143B细胞注入裸鼠皮下),并采用裸鼠皮下成瘤实验检测各组细胞的体内成瘤能力。结果 Western blotting检测结果显示,LETM1蛋白在骨肉瘤MG63及143B细胞中的表达明显高于健康人成骨细胞hFOB1.19(P<0.05),sh-LETM1腺病毒感染MG63及143B细胞后明显降低了LETM1蛋白的表达。细胞克隆形成实验及CCK-8法检测结果显示,在MG63及143B骨肉瘤细胞中,sh-LETM1组较sh-NC组及空白对照组的克隆形成能力及增殖能力明显降低(P<0.01)。Wound-healing实验及Transwell实验结果显示,在MG63及143B骨肉瘤细胞中,sh-LETM1组较sh-NC组及空白对照组的细胞迁移率明显降低(P<0.01)。DAPI染色及流式细胞术结果显示,在MG63及143B骨肉瘤细胞中,sh-LETM1组较sh-NC组的细胞凋亡率明显增高(P<0.01)。ALP染色及茜素红S染色实验结果显示,在MG63及143B骨肉瘤细胞中,sh-LETM1组较sh-NC组及空白对照组染色区域及钙盐结节增多。裸鼠皮下成瘤实验结果显示,143B sh-LETM1组较143B sh-NC组细胞的皮下成瘤能力降低。结论 LETM1可促进MG63和143B骨肉瘤细胞的增殖、迁移及体内成瘤,其机制可能与抑制细胞凋亡及成骨分化有关。

胃癌组织中EPAS1、LETM1蛋白的表达与临床病理特征的关系

目的探讨胃癌患者癌组织中含有内皮PAS结构域的蛋白1(EPAS1)、亮氨酸拉链EF-hand结构域跨膜蛋白1(LETM1)的表达与临床病理特征的关系。方法回顾性分析89例胃癌患者的临床资料,比较胃癌组织与癌旁正常组织中EPAS1与LETM1的表达情况,分析其与胃癌临床病理特征的关系。结果胃癌组织内EPAS1、LETM1免疫组化表达评分均高于癌旁正常组织(P<0.05)。不同年龄、性别、基础疾病类型、肿瘤位置、静脉浸润、淋巴结转移情况、肿瘤直径患者之间EPAS1表达情况比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同TNM分期、分化程度、浸润深度、组织学类型、Lauren's分型患者之间EPAS1表达情况比较,差异有统计学意义(P<0.05)。不同年龄、性别、基础疾病类型、肿瘤位置、静脉浸润、淋巴结转移情况、肿瘤直径、分化程度、组织类型患者之间LETM1表达情况比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同TNM分期、浸润深度、Lauren's分型患者之间LETM1表达情况比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论胃癌患者癌组织中EPAS1、LETM1免疫组化表达评分均高于正常组织,且与多项临床病理特征有关。

豌豆EF-1α的cDNA克隆、全序列及结构特征分析

以赤霉素 (GA)处理后的G2豌豆为材料 ,构建了一个 2 .0× 1 0 6的cDNA文库 ,用随机筛选法从该文库中得到一个 1 6 6 7bp的cDNA ,其 5′端非编码区长 1 0 0bp ,3′端非编码区长 2 2 3bp ,拥有一个 1 34 4bp的开放读码框 ,共编码 447个氨基酸 .DNA及报道的蛋白质序列同源性分析表明 ,它编码了豌豆延伸因子 1α(elongationfactor 1 alpha ,EF 1α) ,其功能区段具有很高的保守性 。

EF-1α基因作为苹果牛眼果腐病菌DNA条形码的评价研究

苹果牛眼果腐病菌(Neofabraea malacorticis、N. perennans、N. kienholzii和N. vagabunda)是我国重点关注的进境水果检疫性有害生物,相似的形态和生理特征使该类真菌的鉴定非常困难。本研究在EF-1α基因区域设计了一对通用引物(NS1/NS4),对不同地理来源的苹果牛眼果腐病菌及其近缘种菌株进行序列分析,考察EF-1α基因是否具备成为苹果牛眼果腐病菌条形码的特征与条件。结果显示, EF-1α基因在苹果牛眼果腐病菌上的PCR扩增和测序成功率均为100%,具有明显的种间和种内遗传变异间距(Barcoding Gap),系统树分析显示该基因片段对4种苹果牛眼果腐病菌及其近缘种具有很好的区分能力,因此认为EF-1α基因可作为苹果牛眼果腐病菌理想的DNA条形码候选片段。