人源性EGFL6的重组表达及多克隆抗体制备研究

目的研究发现人源性类表皮生长因子域EGFL6可促进组织血管新生并在肿瘤组织细胞中表达上调,预示其与肿瘤发生发展密切相关,本研究通过对EGFL6基因克隆,表达和纯化并制备其多克隆抗体,为深入研究EGFL6相关功能奠定基础。方法用实时荧光定量PCR方法检测肿瘤及正常组织细胞系中EGFL6基因表达水平,并扩增EGFL6基因片段,采用基因重组技术构建EGFL6原核表达载体,经诱导表达后利用镍离子柱亲和纯化EGFL6重组蛋白,免疫昆明小鼠制备抗EGFL6多克隆抗体,ELISA、Western blot方法检测抗体灵敏度和特异性。结果 RT-PCR检测发现EGFL6在肿瘤细胞系A375及SKOV3中高表达。成功构建表达载体pET32a(+)-EGFL6,实现可溶性EGFL6蛋白的诱导表达,纯化和抗体制备。SDS-PAGE和Western blot证实,重组EGFL6蛋白质与预期结果一致,抗血清能够特异地识别重组片段蛋白,重组全长蛋白及细胞系中天然EGFL6蛋白。结论 qRT-PCR检测得知EGFL6在肿瘤细胞系A375及SKOV3中表达量较高,并成功实现了EGFL6的重组表达,抗体制备及初步应用研究。

猪EGFL6基因生物信息学分析

为了解猪EGFL6基因基本特性,克隆该基因CDS区,运用生物信息学方法预测分析其氨基酸理化性质、同源性、蛋白功能及二三级结构等。结果表明,猪EGFL6基因CDS区全长1 665 bp,编码554个氨基酸,与人、马、小鼠、绵羊等氨基酸相似性均在75%以上,亲缘关系较近,该蛋白具有亲水性和不稳定性,是分泌蛋白,有12个潜在磷酸化位点,5个保守结构域,无跨膜结构区,无规则卷曲是二三级结构中最主要结构元件。该研究为进一步揭示猪EGFL6基因功能奠定基础。

重组人EGFL6在HEK293细胞中的瞬时表达

旨在通过构建EGFL6的真核表达载体,在HEK293T细胞中进行表达,并利用HEK293T细胞表达的EGFL6条件培养基,探讨EGFL6对人黑色素瘤A375细胞和人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响。利用PCR方法亚克隆得到的EGFL6基因片段及EGFP基因片段,用重叠PCR方法构建成EGFP-EGFL6融合基因片段,并分别将测序正确的EGFP-EGFL6融合基因片段及EGFP基因片段构建到真核表达载体pAAV中。表达载体质粒去内毒素纯化后,瞬时转染HEK293T细胞进行表达,荧光定位分析和Western blot检测EGFL6的表达。CCK-8试验分析含EGFP-EGFL6融合蛋白的HEK293T条件培养基对A375细胞和SKOV3细胞的增殖能力的影响。结果显示,酶切鉴定pAAV-EGFP-EGFL6和pAAV-EGFP两个重组表达载体均构建成功;EGFP荧光定位及Western blot结果均显示EGFP-EGFL6在HEK293T细胞中成功表达;增殖抑制试验结果显示EGFL6促进了A375和SKOV3细胞的增殖,对肿瘤细胞的促增殖率分别达到(37.79±14.05)%和(30.53±6.31)%。成功地将EGFP应用于EGFL6真核表达载体的构建与表达,结果表明人EGFL6促进了A375和SKOV3细胞的增殖。

EGFL6对骨血管生成的调控机制研究进展

骨骼的生长和修复重塑过程中血管因素至关重要。表皮生长因子样结构域6(epidermal growth factor-like domain 6,EGFL6)作为成骨细胞特异性分泌的促血管生成因子,可经由MAPK/ERK、Wnt/β-catenin、BMP/Smad信号通路及其他相关分子调控骨血管的生成。本文就EGFL6调控骨血管生成的机制进行综述,以期为骨愈合受损、骨坏死等骨科临床难题提供新的治疗思路。

沉默EGFL6基因表达抑制卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化

目的:探讨表皮生长因子样结构域蛋白6(EGFL6)在卵巢癌中的表达及其对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化(Epithal-Mesenchymal Transition,EMT)的影响。方法:实验分为si-NC组和si-EGFL6组,将si-EGFL6使用Lipofectamine2000转染至卵巢癌SK-OV-3和OV-90细胞。使用在线工具GEPIA和KM-plotter分析EGFL6在卵巢癌中的表达水平及其与预后的关系。CCK-8实验检测SK-OV-3和OV-90细胞的增殖,划痕愈合实验和Transwell实验分别检测SK-OV-3和OV-90细胞的迁移和侵袭能力,q RT-PCR实验检测SK-OV-3和OV-90细胞中EGFL6的表达水平,Westernblot检测EGFL6及EMT相关基因E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的蛋白表达水平。结果:EGFL6在卵巢癌高表达,和卵巢癌的不良预后相关,具有临床诊断意义。沉默EGFL6表达后,SK-OV-3和OV-90卵巢癌细胞增殖能力受到明显抑制(P<0.01),迁移和侵袭能力降低(P<0.01),EMT相关蛋白Vimentin和N-cadherin蛋白的表达降低,E-cadherin蛋白的表达升高。结论:沉默EGFL6能够抑制卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化。

EGFL6在胃癌血管生成中的作用

目的探讨EGFL6在胃癌血管生成中的作用,为临床肿瘤治疗提供新的分子靶点。方法采用RT-PCR技术检测40例配对新鲜胃癌组织中EGFL6 mRNA的表达。Kaplan-Meier生存曲线分析胃癌中EGFL6的表达与患者预后的关系。采用免疫组化SP法检测50例胃癌组织中EGFL6的表达,并利用CD34计数微血管密度(microvessel density,MVD);RT-PCR及Western blot法检测EGFL6在3株胃癌细胞株中的内源性表达;利用EGFL6过表达病毒上清感染内源性低表达胃癌细胞株,RT-PCR及Western blot法检测感染效率。收集条件培养基,鸡胚尿囊膜实验、小管形成实验及内皮细胞迁移实验观察EGFL6对血管形成的影响。结果胃癌组织中EGFL6 mRNA表达上调,高表达31例,低表达9例(P<0.05);EGFL6表达与胃癌患者预后呈负相关(P<0.05);EGFL6高表达组MVD计数明显高于低表达组(P<0.05);鸡胚尿囊膜实验、小管形成实验、内皮细胞迁移实验结果显示EGFL6促进内皮细胞血管形成(P<0.05)。结论EGFL6具有促进胃癌血管生成能力,EGFL6在胃癌组织中高表达并与患者预后呈负相关;EGFL6为临床抗肿瘤治疗提供新的潜在靶点。

EGFL6促进胃癌细胞增殖、侵袭及转移能力

目的探讨EGFL6表达在胃癌细胞株MGC803增殖、侵袭及转移生物学中的意义。方法采用免疫组化SP法检测40例胃癌及癌旁组织中EGFL6的表达,并进行临床病理相关因素分析。选取EGFL6过表达胃癌细胞株(MGC803/MOCK、MGC803/EGFL6),CCK-8细胞增殖实验、Boyden小室侵袭实验及裸鼠尾静脉肺定植能力实验观察胃癌细胞株体外增殖、侵袭及体内肺定植能力。结果EGFL6在胃癌组织中的表达水平(70%)高于相应癌旁正常胃黏膜组织(12.5%),差异有显著性(χ^(2)=27.29,P<0.001);EGFL6表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关(P均<0.05);过表达EGFL6后,胃癌细胞MGC803的增殖、侵袭能力增强(F=572.3,P<0.0001;t=11.34,P<0.0001),裸鼠尾静脉肺定植能力增强(t=6.200,P=0.0003)。结论EGFL6在胃癌组织中高表达,促进胃癌细胞MGC803体外增殖、侵袭及体内肺定植能力,发挥促癌基因作用。

EGFL6对人膀胱癌细胞体外及裸鼠皮下移植瘤增殖能力的影响

目的探究人表皮生长因子样结构域蛋白6(epidermal growth factor-like domain protein 6,EGFL6)基因在人膀胱癌细胞5637中的低表达对其体外和体内增殖能力的影响。方法将人膀胱癌细胞5637分为实验组和对照组,实验组细胞利用小干扰RNA(siRNA)靶向人EGFL6基因,对照组细胞转染Mock-siRNA;采用实时定量PCR法检测实验组和对照组细胞中EGFL6 mRNA的含量;利用CCK8检测各组细胞的增殖能力;将裸鼠皮下分别注射实验组和对照组人膀胱癌细胞5637,通过裸鼠皮下移植瘤实验检测细胞在体内的增殖能力;通过蛋白免疫印迹检测EGFL6、p-P13K、p-AKT的表达。结果实验组和对照组EGFL6表达量分别为(0.19±0.03)和(0.91±0.11),siRNA-EGFL6降低实验组人膀胱癌5637细胞中EGFL6的蛋白表达;CCK8结果发现实验组和对照组的吸光度分别为(1.558±0.152)、(2.287±0.182),实验组细胞增殖能力明显下降;裸鼠皮下移植瘤结果表明,实验组和对照组裸鼠瘤块体积分别为(1192.07±250.9)、(2280.5±600.1)μm^(3),质量分别为(0.66±0.31)、(1.52±0.48)g,实验组细胞4周之后形成的瘤块体积和质量均下降;蛋白免疫印迹实验结果发现,对照组和实验组p-P13K表达量分别为(0.79±0.14)和(0.33±0.09),p-AKT表达量分别为(0.93±0.13)和(0.28±0.06),证实实验组细胞较于对照组细胞p-P13K、p-AKT均表达下降。结论EGFL6低表达会通过P13K-AKT信号通路抑制人膀胱癌细胞5637的体内与体外增殖能力。