免疫毒素EGFR mab-RTA的制备及鉴定

目的制备由抗表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体(mab)与蓖麻毒蛋白A链(RTA)偶联而成的免疫毒素(IT),并进行鉴定。方法以N-琥珀酰胺-3(-2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)为偶联剂,制备免疫毒素EGFRmab-RTA,SDS-PAGE分析其纯度及成分,DAB显色法检测其对人肝癌HepG2细胞的结合能力。结果 SDS-PAGE分析显示免疫毒素成功构建,偶联物中EGFRmab与RTA的偶联比为1:1.16,免疫毒素基本保留了EGFRmab对HepG2细胞的结合能力。结论利用SPDP可实现EGFRmab与RTA的成功偶联。

mAb-EGFR功能化修饰的纳米金棒靶向光热作用对下咽癌FADU细胞株和293T细胞株的温度影响

目的：探讨上皮生长因子受体单克隆抗体（epidermal grow th factor receptor monoclonal antibody ， mAb－EGFR）功能化修饰的纳米金棒靶向光热作用对下咽癌FADU细胞株和非肿瘤细胞的温度影响。方法在CTAB体系下合成实验所需纳米金棒并完成上皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor ，EGFR）单克隆抗体功能化修饰，用紫外分光光度计及电镜表征；以体外培养的下咽癌FADU 细胞和非肿瘤细胞293T 细胞系为实验材料，用western blot免疫印迹法定性比较两株细胞EGFR的表达及明确细胞内吞纳米金棒；Annexin－5／PI双染法荧光显微镜观察FADU细胞和293T 细胞凋亡情况；设定不同剂量纳米金浓度（15％、25％、35％），应用808 nm波长近红外激光照射6分钟，每隔一分钟检测细胞培养介质温度，并用X T T 法检测细胞存活率。结果纳米金棒浓度在15％～25％、近红外激光照射6分钟时，细胞温度为41～43℃，并且趋于稳定，对下咽癌细胞有明显的杀伤作用（P＜0．05），而对293T 细胞没有明显的杀伤作用，而纳米金棒浓度在35％时对下咽癌 FADU细胞和293T细胞都具有明显的杀伤作用（P＜0．05）。结论浓度为15％～25％ mAb－EGFR功能化修饰的纳米金棒在近红外激光照射6分钟时细胞温度升至41～43 ℃，对下咽癌细胞具有明显的杀伤作用，而对非肿瘤细胞无明显损伤。

抗EGFR/抗CD3双功能抗体对胃癌荷瘤小鼠的免疫治疗研究

目的通过抗EGFR/抗CD3双功能抗体(EGFR/CD3 BsAb)治疗SGC7901胃癌细胞移植瘤小鼠模型,初步验证该抗体在体内对胃癌细胞的杀伤能力。方法采取化学偶联法合成的EGFR/CD3 BsAb联合人外周血淋巴细胞(PBLS)经尾静脉给药注入荷SGC7901胃癌细胞移植瘤小鼠体内。实验裸鼠随机分为抗EGFR单抗联合PBLS组(抗EGFR组)、抗CD3单抗联合PBLS组(抗CD3组)、EGFR/CD3 BsAb联合PBLS组(EGFR/CD3 BsAb组)和空白对照组(生理盐水组)。治疗后检测并比较加药各组对胃癌细胞的杀伤能力。结果 EGFR/CD3 BsAb成功制备,分子量为43kD。EGFR/CD3 BsAb组裸鼠的肿瘤抑制率为(57.2±8.6)%,显著高于抗EGFR组的(38.5±6.1)%和抗CD3组的(6.9±7.6)%(P<0.05);治疗结束时EGFR/CD3 BsAb组的瘤重为(517.1±45.4)mg,显著低于抗EGFR组的(737.4±54.3)mg和抗CD3组的(1097.9±167.7)mg(P<0.05)。各组移植瘤组织EGFR免疫组化染色均为强阳性。EGFR/CD3 BsAb组裸鼠肿瘤组织CD3免疫组化染色可见部分细胞呈阳性。透射电镜观察显示,EGFR/CD3 BsAb组和抗EGFR组可见肿瘤坏死。结论 EGFR/CD3 BsAb在体内条件下可能对胃癌有治疗作用。

mAb-EGFR功能化修饰的金纳米棒靶向光热作用对人咽鳞状细胞癌FaDu细胞株和293T细胞株的细胞毒性分析

目的：探讨mAb-EGFR功能化修饰的金纳米棒靶向光热作用对人咽鳞状细胞癌FaDu细胞株和对非肿瘤细胞的细胞毒性,初步明确特定吸光度的金纳米棒在体外实验中所需剂量。方法：在CTAB体系下合成实验所需金纳米棒并且完成EGFR单克隆抗体功能化修饰,用紫外分光光度计及电镜表征,以体外培养的人咽鳞状细胞癌FaDu细胞和非肿瘤细胞293T细胞系为实验材料,用Western blot免疫印迹法定性比较两株细胞EGFR的表达,及明确细胞内吞金纳米棒。设定不同剂量金纳米棒浓度（15%、25%、35%）,乳酸脱氢酶法比较金纳米棒对FaDu细胞株和293T细胞株毒性差异及初步明确实验剂量。结果：金纳米棒对于FaDu细胞株的细胞毒性高于293T细胞株（P〈0.01）,在293T细胞株实验组中金纳米棒剂量浓度15%、25%两组间无明显差异,而这两组与35%剂量比较均差异有统计学意义（P〈0.01）。结论：mAb-EGFR功能化修饰的金纳米棒在近红外激光照射时对人咽鳞状细胞癌细胞作用表现出比非肿瘤细胞更高的细胞毒性,对于特定吸光度功能化修饰的金纳米棒光热作用杀伤人咽鳞状细胞癌FaDu细胞株的安全剂量浓度为15%~25%。

基于DOE设计的IgG2型抗表皮生长因子受体单抗抗体依赖的细胞吞噬作用生物学活性报告基因检测法的建立及验证

目的通过实验设计(Design of Experiment,DOE)与单因素分析(one factor at a time,OFAT)相结合的方式,建立测定Ig G2型抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)单抗抗体依赖的细胞吞噬作用(antibody dependent cellular phagocytosis,ADCP)生物学活性的报告基因法,并进行验证。方法以Jurkat/NFAT-Re/FcγRⅡa稳转细胞株为效应细胞,A431细胞株为靶细胞,利用JMP软件采取DOE与OFAT相结合的方式,以上下渐近线比值(D/A)为统计量,对实验中7个关键因素进行条件筛选及优化,建立测定Ig G2型抗EGFR单抗ADCP生物学活性的报告基因法,并按照《中国药典》三部/四部(2020版)通则<9401>进行验证。用建立的方法测定Ig G2型抗EGFR单抗注射液生物学活性。结果经过3轮试验,建立了测定Ig G2型抗EGFR单抗ADCP生物学活性的报告基因法,该方法存在量效关系,符合四参数回归方程y=(A-D)/[1+(x/C)^(B)]+D,确定了7个关键条件的耐用范围,即效应细胞密度为(1.25~3.75)×10~4个/孔,效应细胞与靶细胞密度比值为1.0~2.0,靶细胞孵育时间为20~40 min,给药孵育时间为15~30 min,总作用时间为5.5~6.5 h,显色时间为5~30 min,显色剂为荧光素酶检测系统(Bright-Glo)。该方法专属性良好;对5个效价水平进行6次独立试验,线性回归方程相关系数(r)=0.9945,斜率为1.02;5个效价水平相对效价分别为(62.15±1.38)%、(78.53±2.82)%、(99.12±3.95)%、(123.27±4.59)%和(155.22±7.04)%,相对偏倚为-2.9%~0.2%,几何变异系数(generalized cross-validation,GCV)为2.2%~4.6%;在64%~156%范围内具有良好的线性、相对准确度和精密度。Ig G2型抗EGFR单抗生物学活性3次测定结果均值为(101.5±2.8)%。结论本研究建立的报告基因法可用于Ig G2型抗EGFR单抗ADCP生物学活性测定。

重组抗表皮生长因子受体单克隆抗体生物学活性检测方法的建立

目的建立重组抗表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)单克隆抗体生物学活性检测方法。方法利用A-431细胞,对系列梯度稀释的重组抗EGFR单克隆抗体参考品和供试品进行检测,通过四参数方程进行拟合,计算二者的半数有效浓度(EC50)及供试品的相对比活性,并对该方法进行专属性、精密度(重复性、中间精密度)和准确度验证。结果重组抗EGFR单克隆抗体供试品及参考品在该方法中均存在明显的量效关系,四参数拟合的曲线呈典型的反S型曲线。人Ig G1亚型免疫球蛋白(阴性对照)与A-431细胞无交叉反应,不呈现与重组抗EGFR单克隆抗体供试品相似的剂量-反应曲线;同一名试验人员重复6次检测结果的RSD为5%,同一名试验人员3个工作日检测结果的RSD为4%,3名试验人员3次检测结果的RSD为10%,不同浓度的3个供试品溶液生物学活性理论值和检测值的相对误差分别为10%、8%和12%,均满足方法验证的可接受标准。结论成功建立了重组抗EGFR单克隆抗体生物学活性检测方法,该方法专属性较强,精密度良好,准确度较高,可作为重组抗EGFR单克隆抗体生物学活性的常规检测方法。