EIA基因对肿瘤细胞放射敏感性的影响

目的 :利用外源性基因改变肿瘤原有的放射耐受性使其对放疗敏感 ,从而为提高肿瘤放射治疗疗效提供实验依据。方法 :利用本实验室构建的含腺病毒 (Ad5 )早期表达基因EIA的pCDNA3 E1A重组质粒转染肺腺癌Anip 973细胞 ,G418筛选后 ,经PCR ,RT PCR和免疫细胞化学染色鉴定 ,获得含EIA的阳性克隆。将未转染的Anip 973细胞、转染空载体质粒的Anip 973细胞和转染EIA的Anip 973细胞取 0、1、2、3、5、7、10GY剂量点 ,用6MV的X线单次照射以制作放射存活曲线 ;5GY单次照射后不同时间用MTT法测细胞存活。结果 :①转染后的阳性克隆细胞PCR ,RT PCR和免疫细胞化学染色结果说明 :EIA已整合到细胞基因组中并且稳定表达。②细胞放射存活曲线结果显示 :未转染的Anip 973细胞Do =1 14,Dq =1 5 3;空载体转染后的Anip 973细胞Do =1 13,Dq =1 44 ;EIA转染后的Anip 973细胞Do =1 0 2 ,Dq =0 8。未转染及空载体转染后的Anip 973细胞照射后细胞存活无明显差异 ,而EIA转染后的Anip 973细胞照射后细胞存活明显下降 ,存活曲线的肩区变窄 ,Dq值降低。③5GY照射后不同时间转染前后的细胞存活以 14小时最低 ,未转染的Anip 973细胞与转染EIA的Anip 973细胞 14小时存活率分别为 :6 9 5 %、41 5 %。经t检验均有显著差异。结论

Microtrak Ⅱ EIA法检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染

目的 :评价MicrotrakⅡEIA法用于女性宫颈拭子、男性尿道拭子和尿沉渣标本沙眼衣原体检测效果。方法 :采用细胞培养法作为“金标准”方法 ,PCR为辅助标准 ,MicrotrakⅡEIA法平行测定。结果 :共检测 1 64例标本 ,以细胞培养法作金标准 ,总体MicrotrakⅡEIA检出率高于细胞培养法 ( χ2 =5 0 0 ,P <0 0 5 ) ;对于女性宫颈和男性尿沉渣标本 ,MicrotrakⅡEIA法与培养法的检出率无显著性差异( χ2 =1 0 0和 χ2 =0 2 0 ,P均 >0 0 5 ) ,而男性尿道拭子标本的MicrotrakⅡEIA法检出率高于培养法 ,差异有统计学意义 ( χ2 =4 0 0 ,P <0 0 5 )。以细胞培养法加PCR法作标准 ,检测各样本的结果差异无统计学意义。结论 :MicrotrakⅡEIA法具有较高的敏感性和特异性 ,适合于泌尿生殖道沙眼衣原体感染的实验室诊断。

细胞培养、酶联免疫法检测生殖器疱疹病毒的对比性研究

目的分析酶联免疫法(EIA)在检测生殖器疱疹病毒的可行性。方法收集性病门诊患者标本338例进行细胞培养和EIA法检测,另将两法检测结果不相符的标本采用荧光PCR复检,比较分析细胞培养、EIA法与扩大金标准结果的相符性。结果分析表明细胞培养与EIA法检测生殖器疱疹病毒的敏感性均为90.24%,特异性分别为100%和96.29%。结论EIA法检测生殖器疱疹病毒有较高的敏感性而且方法简便、快速,可以用于大批量标本的检测和流行病学的筛查。

细胞培养和酶联免疫法检测沙眼衣原体的比较研究

目的比较细胞培养和酶联免疫法(EIA)检测沙眼衣原体的效果。方法收集性病门诊患者标本1 350例分别进行细胞培养和EIA法检测,另将两法检测结果不相符的标本采用荧光PCR复检,比较分析细胞培养,EIA法与综合结果的相符性。结果分析表明细胞培养与EIA法检测沙眼衣原体的敏感性分别为65.77%和93.96%,特异性分别为100%和99.0%。结论EIA法检测沙眼衣原体有较高的敏感性而且方法简便、快速,可以用于大规模标本的检测,是世界目前实验室最普遍的衣原体筛查方法。

四种检测泌尿生殖道沙眼衣原体方法的比较与评价

目的对胶体金免疫层析、酶免疫(EIA)、直接荧光抗体测定(DFA)和细胞培养四种检测泌尿生殖道沙眼衣原体的方法进行比较与评价。方法分别应用胶体金,EIA,DFA和细胞培养四种方法检测不同稀释倍数的沙眼衣原体E型标准株。35例临床疑为泌尿生殖道沙眼衣原体感染患者的宫颈或尿道拭子分别应用胶体金,EIA,DFA进行检测。结果能测出沙眼衣原体E型标准株为阳性的最大稀释倍数在胶体金,EIA,DFA和细胞培养法中分别为:104,106,108和104倍;35例临床标本的阳性率在胶体金,EIA和DFA法中分别为:11.43%,25.71%和40.00%,胶体金和DFA法之间差异有统计学意义(P<0.05),敏感性最高的为DFA法。结论 DFA法检测泌尿生殖道沙眼衣原体的敏感性较胶体金、EIA和细胞培养方法高,临床上可提倡应用。

原核和真核细胞表达HBeAg的应用研究

目的 :将原核细胞和真核细胞分别克隆表达生产的 HBe Ag,经适当纯化后进行检测分析 ,并在乙型肝炎抗HBe检测中进行应用和比较。 方法 :分别用大肠杆菌和家蚕细胞表达生产 HBe Ag,并用 Saphacryl S- 2 0 0柱层析进行纯化 ;紫外分光光度法测定表达产物的蛋白含量 ;EIA法测定 HBe Ag和 HBc Ag效价及评估 HBe Ag的应用效果。 结果 :原核细胞 HBe Ag:比活性为 10 0 0 0 / m g,HBe Ag/ HBc Ag=5 0 ,用于抗 HBe的检测时特异性为 96 % ,灵敏度符合国家卫生部 panel要求。真核细胞 HBe Ag:比活性为 16 0 0 0 0 / m g,HBe Ag / HBc Ag =5 0 0 0 ,用于抗 HBe的检测时特异性为 10 0 % ,灵敏度高于国家卫生部 panel要求的 1～ 2个滴度。 结论 :真核细胞表达的 HBe Ag比活性高而 HBc Ag含量低 ,在抗

表达红色荧光蛋白的小鼠淋巴瘤EL4细胞株的建立及鉴定

本研究通过慢病毒载体将红色荧光蛋白(DsRed)导入小鼠淋巴瘤EL4细胞,建立稳定高表达DsRed的EL4/DsRed细胞株,为建立携带红色荧光标记的小鼠肿瘤模型奠定基础。构建含新霉素耐药基因(neo)、内部核糖体进入位点序列(IRES)及DsRed的双顺反子自身失活型慢病毒载体。采用脂质体转染法将慢病毒三质粒包装系统共转染人胚肾细胞系293FT包装细胞,收集病毒上清,感染EL4细胞;利用G418的药物选择特性筛选感染细胞获得稳定表达DsRed的EL4细胞株,并扩大培养。结果表明:成功构建慢病毒表达质粒pXZ208-neo-IRES-DsRed,包装的重组慢病毒滴度可达106U/ml。病毒感染EL4细胞,经终浓度为600μg/ml的G418成功筛选出稳定携带DsRed的EL4/DsRed细胞株;荧光显微镜观察及流式细胞仪检测证实该细胞株长期稳定高表达DsRed。结论:通过表达DsRed的慢病毒载体感染EL4细胞,获得了稳定高表达DsRed的EL4/DsRed细胞株。

小鼠B7-1和B7-2基因转染EL4细胞瘤苗抗肿瘤免疫作用的比较研究

目的:比较小鼠免疫共刺激信号B7-1和B7-2转化小鼠淋巴瘤细胞株EL4后,转化细胞介导的抗肿瘤免疫作用。方法:构建逆转录病毒表达载体pLXSN-mB7-1和pLXSN-mB7-2,转染野生型EL4细胞,获得高表达B7-1和B7-2分子的EL4/mB7-1和EL4/mB7-2细胞,并制备成瘤苗;分别应用LDH释放法、MTT法以及ELISA法检测比较两种瘤苗激活的T细胞的杀伤活性、细胞增殖和IL-2的分泌情况。结果:①EL4/mB7-1和EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠脾脏T淋巴细胞分泌IL-2的量明显超过野生型EL-4细胞(P<0.01);②24 h,EL4/mB7-1瘤苗刺激小鼠脾脏T淋巴细胞分泌的IL-2的量超过EL4/mB7-2瘤苗(P<0.05);48 h,EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠脾脏T淋巴细胞分泌IL-2的量超过EL4/mB7-1瘤苗(P<0.05);③EL4/mB7-1瘤苗和EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的活性明显增强。EL4/mB7-2瘤苗刺激小鼠T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的活性与EL4/mB7-1瘤苗相当(P>0.05)。结论:mB7-1和mB7-2分子可活化T细胞分泌IL-2,两者刺激T细胞产生IL-2的高峰时间不同。mB7-2刺激T细胞产生CTL的杀伤活性与mB7-1无明显差别。

维生素E对邻苯二甲酸二丁酯细胞毒性的影响

目的探讨邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对小鼠淋巴瘤细胞(EL4)的毒作用及维生素E(VitE)对细胞的保护作用。方法分别用10、100、500、1000μmol/LDBP作用细胞24h,并且VitE进行干预,检测细胞增殖、乳酸脱氢酶(LDH)活力及丙二醛(MDA)含量。结果DBP作用EL4细胞24h,100～1000μmol/LDBP均能明显促进EL4细胞增殖。1000μmol/LDBP可明显升高EL4细胞上清液中LDH活力及MDA含量。与1000μmol/LDBP组比较,50μmol/LVitE能显著降低细胞上清液中LDH活力及MDA含量。结论DBP使EL4细胞产生氧化损伤,这可能与DBP的免疫毒性有关。

E1A基因对人宫颈癌细胞放射增敏的实验研究

目的探讨E1A基因对人宫颈癌细胞的放射增敏作用及其初步的作用机制。方法将人宫颈癌细胞(Hela)、转染空载体纳米粒的人宫颈癌细胞(Hela-vector)及转染E1A基因的人宫颈癌细胞(Hela-E1A)分别给以0、2、4、6和8Gy的6MV-X线照射,用集落形成法计算细胞存活分数及放射增敏比(SER),检测E1A基因对人宫颈癌细胞对放射线敏感性的影响;采用RT-PCR检测E1A基因的表达以及E1A基因对Her-2基因表达的影响,采用流式细胞术检测E1A基因对细胞周期的影响。结果集落形成实验结果显示:经不同剂量照射后Hela-E1A组平均细胞存活分数明显低于Hela和Hela-vector组,而后两组相近。Hela-E1A组D0值为1.23,Hela和Hela-vector组D0值分别为2.51和2.59,放射增敏比(SER)=(2.04);RT-PCR结果显示:E1A基因在Hela细胞中能稳定表达,E1A基因的转染明显降低了Her-2基因在Hela细胞中的表达水平;流式细胞术结果显示:转染E1A基因后,细胞周期出现S期抑制,G2期阻滞。结论E1A基因能够明显提高人宫颈癌细胞对放射线的敏感性,其作用机制可能与E1A基因抑制了该细胞Her-2基因的表达,使细胞周期再分布有关。

基于笛卡尔切割单元法的复杂河道地理信息系统环评可视化

复杂河道中污染物扩散计算及其在地理信息系统(GIS)上的可视化,对于地表水环境影响评价(EIA)具有非常重要的意义,但在网格生成、污染物计算模型及计算结果可视化方面存在着诸多困难。针对点源岸边排放河流污染物计算及基于GIS可视化中的难点问题,提出了基于切割单元法的地面水环境影响评价可视化方法。将切割单元法应用于网格剖分,通过切割单元交点追踪算法及河道轮廓线内背景网格筛取算法,生成了复杂河道笛卡尔网格。提出了基于污染物二维稳态衰减模式的网格自适应加密与稀疏算法,在非结构化笛卡尔网格基础上采用了基于河流几何信息判断的点源岸边排放河流污染预测算法与区域填充算法,实现了环境影响评价计算结果的可视化显示。通过一个河流污染环境影响评价可视化的实例,验证了所提方法的可行性与有效性。

srhM-CSFR在昆虫细胞中的表达及其配基结合活性分析

从人胎盘中提取总 RNA,利用 RT- PCR技术扩增出巨噬细胞集落刺激因子受体 ( M-CSFR)胞外区的、具有全部配基结合活性区域的前三个免疫球样蛋白结构域的 DNA,将其克隆到杆状病毒载体 pbluebac4.5中 ,与杆状病毒 DNA一同转导昆虫细胞 Sf9.经过 2轮筛选 ,获得了纯化的重组病毒 ,再用重组病毒感染昆虫细胞 ,Western印迹检测证明 srh M- CSFR得到了表达 ,它是分泌到上清液中的糖基化蛋白 .Western印迹分析了不同时间点的 srh M- CSFR表达情况 ,结果表明 srh M- CSFR的表达在 96～ 1 2 0 h时达到最大 .srh M- CSFR的产量约为 1 mg/L,EIA法进行配基结合活性分析表明 ,srh M- CSFR与 M- CSF结合的解离常数为 5nmol/L.

应用HIV感染的常规检测指标辅助判定新发感染的研究

目的通过回顾性分析云南省德宏州2015—2017年新报告HIV感染者中的病毒学和免疫学检测指标的分布情况,探索将常规的HIV感染检测结果用于辅助综合判定HIV新发感染检测的可行性。方法收集德宏州2015—2017年新报告HIV感染者样本1 152份,通过抗体亲和力实验判定新近感染者和长期感染者,并分析两组感染者中CD4+T细胞计数、病毒载量值、抗体酶联免疫反应S/CO值、以及免疫印迹实验出现p31条带的结果。进一步分析应用不同的检测指标进行新发感染综合判定得到的结果。结果 1 152例新报告HIV感染者中通过抗体亲和力实验判定205例为新近感染者,947例为长期感染者。新近感染者中CD4+T细胞计数<200个/μl的比例、抗体酶联免疫反应S/CO值>20的比例、免疫印迹实验出现p31条带的比例均显著低于长期感染者。抗体亲和力实验结合CD4+T细胞计数<200个/μl或病毒载量检测值<1 000 CPs/ml的新发感染综合判定策略可分别区分出30例和31例误判的新近感染者;抗体亲和力实验同时结合CD4+T细胞计数<200个/μl和病毒载量检测值<1 000 CPs/ml的新发感染综合判定策略可区分出60例误判的新近感染者。结论常规HIV检测结果可用于辅助新发感染抗体亲和力实验结果综合判断新近感染,新发感染综合判定策略可以提高新近感染者判定的准确性。

非小细胞肺癌组织中E1AF、MMP-7、uPA的表达及其临床意义

目的检测非小细胞肺癌(NSCLC)组织中E1A因子(E1AF)、基质溶解素(MMP-7)、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)的表达及其与临床病理特征之间的关系。方法采用免疫组织化学技术检测56例NSCLC组织及其癌旁配对正常肺组织中MMP-7、uPA蛋白的表达,采用RT-PCR方法检测E1AFmRNA的表达。结果与癌旁配对正常肺组织相比,NSCLC中E1AFmRNA、MMP-7和uPA表达明显升高(P<0.01),E1AF表达与MMP-7及uPA的表达分别呈正相关(P<0.05);MMP-7与uPA表达无显著相关性(P>0.05);E1AF、MMP-7、uPA表达均与组织类型无关,E1AF、MMP-7与分化程度有关,uPA与肿瘤大小有关,三者均与TNM合并分期和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。结论 E1AF、MMP-7和uPA在NSCLC组织中的表达与肿瘤的浸润、转移有关,E1AF可能在转录水平上调控MMP-7和uPA的表达,E1AF基因可作为肺癌基因诊断和治疗的新靶点,联合检测有助于判断患者的预后。