EIA基因对肿瘤细胞放射敏感性的影响

目的 :利用外源性基因改变肿瘤原有的放射耐受性使其对放疗敏感 ,从而为提高肿瘤放射治疗疗效提供实验依据。方法 :利用本实验室构建的含腺病毒 (Ad5 )早期表达基因EIA的pCDNA3 E1A重组质粒转染肺腺癌Anip 973细胞 ,G418筛选后 ,经PCR ,RT PCR和免疫细胞化学染色鉴定 ,获得含EIA的阳性克隆。将未转染的Anip 973细胞、转染空载体质粒的Anip 973细胞和转染EIA的Anip 973细胞取 0、1、2、3、5、7、10GY剂量点 ,用6MV的X线单次照射以制作放射存活曲线 ;5GY单次照射后不同时间用MTT法测细胞存活。结果 :①转染后的阳性克隆细胞PCR ,RT PCR和免疫细胞化学染色结果说明 :EIA已整合到细胞基因组中并且稳定表达。②细胞放射存活曲线结果显示 :未转染的Anip 973细胞Do =1 14,Dq =1 5 3;空载体转染后的Anip 973细胞Do =1 13,Dq =1 44 ;EIA转染后的Anip 973细胞Do =1 0 2 ,Dq =0 8。未转染及空载体转染后的Anip 973细胞照射后细胞存活无明显差异 ,而EIA转染后的Anip 973细胞照射后细胞存活明显下降 ,存活曲线的肩区变窄 ,Dq值降低。③5GY照射后不同时间转染前后的细胞存活以 14小时最低 ,未转染的Anip 973细胞与转染EIA的Anip 973细胞 14小时存活率分别为 :6 9 5 %、41 5 %。经t检验均有显著差异。结论

产细胞毒素幽门螺杆菌IgG抗体EIA试剂盒的研制与初步应用

产细胞毒素幽门螺杆菌是消化道溃疡、胃癌等疾病的主要致病菌 ,临床可用血清学检测 HP- Cag A Ig G。本文用重组 Cag A蛋白抗原建立 EIA ,并研制成相应试剂盒。实验证实 ,本试剂盒与 Western Blot试剂盒检测 HP-Cag A Ig G的总符合率为 91.3%。并具有特异性强、精密度高、稳定性好及操作简便等优点。临床初步应用提示它有助于消化道疾病的早期诊治和预报。

E1A基因对人宫颈癌细胞放射增敏的实验研究

目的探讨E1A基因对人宫颈癌细胞的放射增敏作用及其初步的作用机制。方法将人宫颈癌细胞(Hela)、转染空载体纳米粒的人宫颈癌细胞(Hela-vector)及转染E1A基因的人宫颈癌细胞(Hela-E1A)分别给以0、2、4、6和8Gy的6MV-X线照射,用集落形成法计算细胞存活分数及放射增敏比(SER),检测E1A基因对人宫颈癌细胞对放射线敏感性的影响;采用RT-PCR检测E1A基因的表达以及E1A基因对Her-2基因表达的影响,采用流式细胞术检测E1A基因对细胞周期的影响。结果集落形成实验结果显示:经不同剂量照射后Hela-E1A组平均细胞存活分数明显低于Hela和Hela-vector组,而后两组相近。Hela-E1A组D0值为1.23,Hela和Hela-vector组D0值分别为2.51和2.59,放射增敏比(SER)=(2.04);RT-PCR结果显示:E1A基因在Hela细胞中能稳定表达,E1A基因的转染明显降低了Her-2基因在Hela细胞中的表达水平;流式细胞术结果显示:转染E1A基因后,细胞周期出现S期抑制,G2期阻滞。结论E1A基因能够明显提高人宫颈癌细胞对放射线的敏感性,其作用机制可能与E1A基因抑制了该细胞Her-2基因的表达,使细胞周期再分布有关。

CagA抗体检测用于鉴定幽门螺杆菌高毒株感染的评价

目的探讨通过检测血清CagA抗体鉴定幽门螺杆菌高毒株感染的可行性。方法采集本地区临床门诊行胃镜检查的胃活检标本,作病理检查和幽门螺杆菌(Hp)培养,同时采集病人的血清。采用PCR法检测分离所得的HpcagA基因,用EIA法测定患者血清CagA抗体,分析cagA基因的检出与消化性疾病的关系,比较cagA基因与CagA抗体的检测结果,评价应用CagA抗体检测Hp高毒株感染的可行性。结果分离获得80株Hp,其中54株检出cagA基因,阳性率为67.50%。各病理类型胃病患者cagA基因阳性率分别为:浅表性胃炎77.42%,萎缩性胃炎62.86%,胃溃疡58.33%,胃癌50.00%,各组间无显著差异(P>0.05);EIA法检测CagA抗体的阳性率为55.00%,敏感度为74.07%,特异度为84.62%,约登指数(Youden's index)58.69%,调整一致性77.68%。结论检测血清CagA抗体用于诊断高毒力Hp感染存在局限性。

用现行国产HBsAg EIA检测乙肝S基因突变体问题的研究

目的探讨乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）突变体对抗体结合能力的影响，寻找鉴别变异株的办法和规律，并为改进试剂质量进行基础研究。方法用２３家国产ＨＢｓＡｇＥＩＡ检测１０株重组表达ＨＢｓＡｇ突变体和１株原型ＨＢｓＡｇ。结果２３家国产试剂均能检测出原型、重组表达ＨＢｓＡｇ。表达的１０株突变体，１号试剂可全部检出，其它试剂的检出率分别为：对突变体抗原１４５精氨酸、１３３亮氨酸、１２６天冬酰胺的检出率为９１％，１４２丝氨酸为８６％，１４２亮氨酸为８２％，１２９组氨酸为７８％，１４１谷氨酸为３４％，１２６丝氨酸为３０％，１４４丙氨酸为２６％，１４５精氨酸＋１２６丝氨酸为１７％。结论乙肝Ｓ基因不同位点变异可导致与某些单抗的结合力降低，为进一步发展检测鉴别ＨＢｓＡｇ突变体的诊断试剂提供了理论基础。

庚型肝炎病毒NS5区部分基因的表达及其在EIA中的初步应用

目的 在大肠杆菌中表达HGVNS5抗原 ,以建立HGV抗体血清学检测方法。方法 利用反转录PCR(RT PCR)法从人血浆中分离庚型肝炎病毒NS5部分基因 ,克隆到pRSETA载体 ,经酶切初步鉴定后进行DNA序列分析 ,结果表明克隆序列正确。以pPROEX 1为表达载体 ,转化DH5α ,诱导表达后进行SDS PAGE和Westernblot分析。结果 克隆的基因片段在大肠杆菌中表达出相对分子质量 (Mr)约 2 0× 10 3 的可溶性蛋白 ,其氨基端含有 6个组胺酸肽段 ,可经Ni NTA亲和层析纯化。免疫印迹分析表明 ,该表达产物可与HGV感染患者体内的HGV抗体特异性结合。结论 克隆了HGVNS5部分基因并获得初步表达 ,表达的HGVNS5蛋白具有特异抗体结合活性 。

心肌缺血再灌注损伤小鼠E1A激活基因阻遏子基因表达及其对心肌的保护作用

目的探讨心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MIR)小鼠E1A激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A-stimulated gene,CREG)表达变化,及其对损伤心肌的保护作用。方法 CREG基因半敲除C57BL/6模型小鼠18只(A组),36只未敲除CREG基因C57BL/6小鼠随机分为B、C组各18只,3组采用线栓法制备MIR模型。建模前B组皮下微渗透泵给予外源性重组CREG蛋白1.5mg/(kg·d),连续14d,A、C组给予等量生理盐水。MIR后2h各组均处死6只小鼠,采用Western blot法检测心肌CREG蛋白表达,反转录PCR法检测心肌CREG mRNA表达;MIR后12h各组均取6只小鼠检测左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume,LVEDV)、左心室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume,LVESV),血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、谷草转氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase,GOP)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH);MIR 24h检测各组剩余6只小鼠心肌细胞凋亡指数。结果 A组心肌组织CREG蛋白、CREG mRNA表达(0.33±0.07、0.51±0.09)低于B组(0.85±0.19、0.97±0.10)、C组(0.67±0.15、0.99±0.05)(P<0.05);C组CREG蛋白表达低于B组(P<0.05),CREG mRNA表达与B组比较差异无统计学意义(P>0.05);A组LVEF[(34.2±3.1)%]低于B、C组[(58.7±5.1)%、(41.4±4.5)%](P<0.05),LVEDV[(121.8±14.0)μL]、LVESV[(77.2±9.0)μL]高于B组[(93.1±7.7)、(43.8±6.1)μL]、C组[(95.0±8.5)、(45.2±5.4)μL](P<0.05),C组LVEF低于B组(P<0.05);A组血清CK[(1 481.6±339.2)]u/L、CK-MB[(539.5±54.0)u/L]、GOP[(519.8±43.2)u/L]、LDH[(923.8±211.3)u/L]高于B组[(682.3±155.9)、(458.7±44.4)、(431.2±29.7)、(401.4±98.6)u/L]、C组[(874.0±193.5)、(489.1±47.1)、(460.0±32.5)、(600.5±115.8)u/L](P<0.05),且C组各指标均高于B组(P<0.05);A组心肌细胞凋亡指数[(57.21±2.26)%]明显高于B、C组[(16.94±1.75)%、(26.16±1.90)%](P<0.05),C组高于B组(P<0.05)。结论 CREG蛋白高表达对MIR心肌具有保护作用,其机制可能与减轻心肌细胞凋亡、降低心肌酶水平有关。