稳定表达结核分枝杆菌38抗原的EL-4细胞株的建立及鉴定

将结核分枝杆菌的38抗原基因片段经PCR方法扩增并插入到pcDNA3真核表达载体中,通过脂质体转染EL-4细胞,经G418筛选,用RT-PCR方法和ELISA方法检测整合和表达情况。结果成功地构建了pcDNA3-38抗原重组质粒,转染细胞中可检测到38抗原的存在,PCR扩增也证实38抗原基因已稳定整合于EL-4细胞的染色体中。本实验为今后在小鼠体内检测结核DNA疫苗激发的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应奠定了基础。

p53蛋白在低剂量电离辐射诱导EL-4细胞适应性反应中的变化

目的:研究低剂量电离辐射诱导EL-4细胞适应性反应中p53 mRNA及蛋白的表达,为探讨低剂量电离辐射诱导细胞适应性反应的DNA损伤修复机制提供实验依据。方法:将EL-4细胞分为空白对照组,单纯照射组(其照射剂量分别为1 Gy、2 Gy和3 Gy),以及诱导适应性反应照射组(其照射剂量分别为75 mGy+1 Gy、75 mGy+2 Gy、75 mGy+3 Gy)。应用流式细胞仪和RT-PCR方法分别检测p53蛋白及mRNA水平表达。结果:单纯照射组p53蛋白水平较对照组显著升高(P<0.01),预先给予75 mGy照射诱导的适应性反应组其p53蛋白水平较单纯照射组则显著降低(P<0.01)。p53 mRNA水平表现出与p53蛋白表达相同的变化。结论:p53蛋白在诱导适应性反应照射组中低表达,说明其在低剂量电离辐射诱导适应性反应中可能起重要作用。

电离辐射对EL-4细胞的p53蛋白及其下游基因MDM2 mRNA和蛋白表达的影响

采用流式细胞术和 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交检测了 Ｘ射线照射后 ＥＬ－４细胞中 ｐ５３蛋 白及其下游基因 ＭＤＭ２ｍＲＮＡ和蛋白表达的变化，以探讨 Ｘ射线照射诱导 ＥＬ－４细胞 Ｇ１期 阻滞的分子机制。结果表明：经 ４Ｇｙ Ｘ射线照射后的 ＥＬ－４细胞， ｐ５３蛋白表达在照射后 ２ｈ增 高， ４ｈ达峰值，持续至照射后 ２４ｈ（ｐ＜ ０．０５～ ０．００１）； ＭＤＭ２蛋白的表达在照射后 ４～２４ｈ 明显升高（ｐ＜ ０．０５～ ０．０１）。进一步观察 Ｘ射线照射后 ＭＤＭ２ ｍＲＮＡ 水平的时程变化后 发现，在经 ４Ｇｙ Ｘ射线照射后的 ＥＬ－４细胞中， ＭＤＭ２ ｍＲＮＡ水平在照射后 １～８ｈ有增高 趋势，其中， ２ｈ明显升高（ｐ＜０．０１）。结果表明； Ｘ射线照射 ＥＬ－４细胞可通过 ｐ５３蛋白诱 导 ＭＤＭ２蛋白表达，从而限制 Ｇ１期阻滞的时间，使 ＤＮＡ损伤修复后的细胞重新进入细胞周 期。

4GyX射线照射对EL-4细胞cyclin B1及cdc2 mRNA水平的影响

采用流式细胞术和半定量 RT-PCR 的方法分别检测 4Gy X 射线照射后 EL-4 细胞不同细胞周期时相和EL-4 细胞内 cyclin B1 及 cdc2 mRNA 水平的时程变化,以探讨 X 射线照射诱导 EL-4 细胞 G2 期阻滞的分子调控机制。 结果表明,4Gy X 射线照射 EL-4 细胞后 2h,G2期细胞开始明显增多,4—8h 达峰值(p<0.001)。EL-4 细胞内 cyclin B1 mRNA 水平于照射后 1h 开始下降,24h 降至最低值,为假照组的 57.7 %,72h 恢复至正常水平。EL-4 细胞中 cdc2 mRNA 水平于照射后 12h 开始降低,24—48h 降至最低水平,分别为假照组的59.2% 和 58.9%,72h 恢复至假照组水平。结果提示, 4Gy X 射线照射可诱导 EL-4 细胞 cyclin B1 及 cdc2 mRNA水平明显下降,直接导致 MPF 活性减少是引发 G2 期阻滞的关键。

X射线照射对EL-4细胞内NF-κB的DNA结合活性的影响

通过电泳移动变化分析 (EMSA)及免疫组织化学 (IHC)的方法分别检测了 2 Gy和 0 .0 75 GyX射线照射的 EL- 4细胞内转录因子 NF- κB的 DNA结合活性的时程变化和 p6 5亚基胞浆胞核分布情况及 NF- κB抑制因子 IκBα水平的时程变化。结果表明 ,2 Gy和 0 .0 75 Gy X射线照射均可诱导 NF- κBp5 0 / p5 0和 p5 0 / p6 5的 DNA结合活性增强 ,但两种二聚体在两种剂量照射后的结合活性比值不同。0 .0 75 Gy照射诱导 p5 0 / p6 5活性增强为主 ,2 Gy照射诱导 p5 0 / p5 0活性增强为主。2 Gy和 0 .0 75 Gy均诱导 p6 5核转位增多和 IκBα的先降解后表达增多 ,但程度不同。提示不同剂量照射引起的转录调节变化不同 ,因此引起不同的细胞效应。

夏枯草提取物体内外对小鼠T淋巴瘤EL-4细胞生长的影响

目的:观察夏枯草提取物体内外对小鼠T淋巴瘤EL-4细胞生长的影响,探讨夏枯草提取物的抗肿瘤作用机制。方法:用MTT法、DNA琼脂糖凝胶电泳、TUNEL等方法检测夏枯草提取物体外对小鼠T淋巴瘤EL-4细胞生长的影响。建立C57BL/6小鼠EL-4细胞移植瘤模型,分别给予500、300、100mg/(kg·d)夏枯草提取物,10d后,计算抑瘤率,对肿瘤组织进行形态学观察,并测定其中Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。结果:夏枯草提取物体外能抑制EL-4细胞生长,半数抑制浓度(IC50)为(23.67±3.05)mg/L;夏枯草提取物能诱导EL-4细胞凋亡。夏枯草提取物能抑制EL-4细胞在C57BL/6小鼠体内的生长,500、300、100mg/(kg·d)剂量组的抑瘤率分别为(39.54±1.83)%、(65.26±1.31)%、(22.30±3.7)%,平均生存时间分别为(25.50±1.87)、(28.50±2.62)、(24.86±2.19)d,均大于空白对照组(P<0.05),移植瘤Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达增加。结论:夏枯草提取物在体内外均能抑制EL-4细胞的生长,诱导凋亡可能是其抗肿瘤的主要机制之一。

X射线对Jurkat和EL-4细胞周期进程的影响

目的:探讨较大剂量X射线照射对Jurkat和EL-42种T淋巴细胞周期进程的影响。方法:采用碘化丙啶(PI)荧光标记及流式细胞术(FCM)分别检测2.0GyX射线照射后不同时间点(0、4、8、16、24和48h)Jurkat与EL-4细胞周期进程变化的时间-效应关系和1.0、2.0和4.0Gy不同剂量X射线照射后两者的剂量-效应关系。结果:与各时间点对应的假照组比较,2.0GyX射线照射后Jurkat细胞G0/G1期和S期细胞百分率降低(P<0.01),G2+M期细胞百分率增高(P<0.01),于照射后24h变化最为显著;EL-4细胞G2+M期细胞百分率于照射后4～8h增高(P<0.01),G0/G1期细胞百分率于照射后8～48h增高(P<0.05或P<0.01),S期细胞百分率于照射后8～24h降低(P<0.01)。1.0～4.0GyX射线照射后16h,随着剂量的增加,与假照组比较,Jurkat细胞G0/G1期和S期细胞百分率降低(P<0.05或P<0.01),G2+M期细胞百分率增加(P<0.01);随着剂量的增加,与假照组比较,EL-4细胞G0/G1期细胞百分率升高(P<0.01),S期细胞百分率降低(P<0.01),G2+M期细胞百分率仅在4.0GyX射线照射后显著增高(P<0.01)。结论:1.0～4.0GyX射线照射可以改变Jurkat与EL-4细胞周期进程,诱导Jurkat细胞发生G2期阻滞,EL-4细胞发生G1期和G2期阻滞。

人补体杀伤小鼠胸腺瘤EL-4细胞的机制及其非致死模型的建立

目的探讨人血清 补体 杀伤小鼠胸腺瘤EL-4细胞的机制,建立补体杀伤T淋巴细胞的非致死模型。方 法用阻断补体活 化途径的方法探讨EL-4细胞活化人补体系统的机制,以MTT比色及LDH释放法绘制不同浓度 的人血清补体对EL-4细胞的裂解曲线,并以此确定非致死剂量。结果未致敏EL-4细胞可直接以Ca^(2+)、Mg^(2+)离子依赖的第一 途径活化人血清补体系统,在细胞数为1×10~4～2×10~4时,1∶200稀释的 人血清补体为EL-4细胞的非致死剂量。结论本研究 为探讨补体非致死性攻击在T淋巴细胞活化中的作用提供了良好的模型。多次实验结果表明 :本模型具有稳定、重复性好及剂量容易控制的优点,可供实验研究采用。

ATM基因在低剂量电离辐射诱导EL-4细胞适应性反应中的作用

目的:探讨低剂量电离辐射诱导EL-4细胞适应性反应中ATM基因的作用。方法:EL-4细胞应用渥曼青霉素处理后接受低剂量0.075 Gy预先照射,再分别进行较高攻击剂量照射(1.0,1.5和2.0 Gy),RT-PCR和免疫荧光法检测ATM mRNA及蛋白表达。同时应用流式细胞术检测细胞凋亡和周期进程变化。结果:渥曼青霉素能够阻断ATM基因在mRNA及蛋白水平的表达。应用渥曼青霉素后直接接受攻击剂量照射和应用渥曼青霉素后先接受低剂量0.075Gy预先照射后再接受攻击剂量照射,均能诱导EL-4细胞发生适应性反应。结论:ATM基因可能不影响低剂量电离辐射诱导EL-4细胞发生适应性反应。

电离辐射和5-氟尿嘧啶对EL-4细胞周期的解偶联作用

目的：研究电离辐射和5-氟尿嘧啶（5-FU）对EL-4细胞周期解偶联的时间-效应关系和剂量-效应关系。方法：取指数生长期EL-4细胞，采用不同照射剂量（0、1．0、2．0和4．0Gy）电离辐射和不同浓度5-FU（0、0．001、0．010、0．100和1．000mg·L^-1）处理EL-4细胞，于0、4、8、16、24和48h后分别收集细胞，碘化丙啶（PI）荧光标记及流式细胞术（FCM）检测细胞倍体变化。结果：与假照组比较，2．0Gy X射线照射后，EL-4细胞二倍体细胞百分率在照射后8～24h显著增加（P〈0．05或P〈0．01），48h恢复至正常水平；四倍体细胞百分率在照射后8～48h显著降低（P〈0．05或P〈0．01）；八倍体细胞百分率在照射后16～24h显著降低（P〈0．05）。1．0～4．0Gy X射线照射后16h，与假照组比较，二倍体细胞百分率剂量依赖性增加（P〈0．05或P〈0．01），四倍体细胞百分率呈剂量依赖性下降（P〈0．01），八倍体细胞百分率变化不显著。0．100mg·L^-15-FU给药后，与0mg·L^-1组比较，EL-4细胞二倍体细胞百分率在给药后16～48h显著降低（P〈0．01）；四倍体细胞百分率在给药后8～24h显著增加（P〈0．05或P〈0．01），48h回降；八倍体细胞百分率在给药后4～16h显著增加（P〈0．05）。不同剂量5-FU给药后16h，与0mg·L^-1组比较，EL-4细胞二倍体细胞百分率显著降低（P〈0．05或P〈0．01），四倍体细胞百分率显著增加（P〈0．05或P〈0．01），二者变化在0．001～1．000mg·L^-1剂量范围内呈剂量依赖性；八倍体细胞百分率仅在0．010和0．100mg·L^-1组显著增加（P〈0．05或P〈0．01）。结论：1．0～4．0Gy电离辐射无诱导EL-4细胞发生细胞周期解偶联作用，0．010～0．100mg·L^-1 5-FU可以诱导EIL-4细胞发生细胞周期解偶联。

CD 59在sM AC诱导EL-4细胞增殖效应中的作用

以表达人ＣＤ５９ｃＤＮＡ 及ＣＤ５９－ＴＭｃＤＮＡ 的小鼠胸腺瘤（ＥＬ－４）细胞为研究对象，探讨了ＣＤ５９在ｓＭＡＣ诱导ＥＬ－４细胞增殖效应中的作用。结果发现：１）用抗体交联ＣＤ５９分子对ＣＤ５９／ＥＬ－４细胞的增殖有促进效应，而对ＣＤ５９－ＴＭ／ＥＬ－４细胞的增殖无明显影响（Ｐ＜ ０．０１）；２）ｓＭＡＣ对ＣＤ５９／ＥＬ－４细胞的增殖有促进作用，而对ＥＬ－４及ＣＤ５９－ＴＭ／ＥＬ－４细胞则均未出现上述现象（Ｐ＜ ０．０１）；３）阻断信号传导的蛋白酪氨酸激酶途径对上述ＣＤ５９及ｓＭＡＣ介导的ＣＤ５９／ＥＬ－４细胞的增殖有不同的抑制效应。结果提示：ＣＤ５８参与了ｓＭＡＣ诱导ＥＬ－４细胞增殖的效应过程。

5-氟尿嘧啶对Jurkat和EL-4细胞周期解偶联的影响

目的:研究5-氟尿嘧啶(5-FU)不同剂量和给药后不同时间Jurkat和EL-4细胞周期解偶联的变化规律。方法:采用不同剂量(0、0.001、0.010、0.100和1.000mg·L-1)5-FU处理Jurkat和EL-4细胞,给药0、4、8、16、24和48h后分别收集细胞,应用碘化丙啶(PI)荧光标记及流式细胞术(FCM)检测分析细胞倍体变化的剂量-效应和时间-效应规律。结果:不同剂量5-FU给药后16h,Jurkat细胞八倍体细胞百分率在0.001、0.010、0.100和1.000mg·L-1各个剂量组均显著低于0mg·L-1组(P<0.01),无剂量依赖性;EL-4细胞八倍体细胞百分率在0.010和0.100mg·L-1组显著高于0mg·L-1组(P<0.05)。0.100mg·L-15-FU给药后,Jurkat细胞八倍体细胞百分率在8、16和24h显著低于相应对照组(P<0.01),48h显著高于相应对照组(P<0.01);EL-4细胞八倍体细胞百分率在4、8和16h显著高于相应对照组(P<0.05),48h显著低于相应对照组(P<0.01)。结论:5-FU可以诱导EL-4细胞发生细胞周期解偶联,而不能诱导Jurkat细胞发生细胞周期解偶联。

T淋巴瘤EL-4细胞双受体表达研究

目的:检测T淋巴瘤EL-4细胞T细胞受体(T cell receptor,TCR)的表达情况,为进一步研究T细胞等位基因排斥机制奠定基础。方法:以小鼠脾细胞作为阳性对照,分别提取脾细胞和EL-4细胞mRNA,逆转录为cDNA,RT-PCR扩增24个TCR BV家族CDR3区,结合基因扫描(GeneScan)和基因测序技术,对有表达的TCR BV家族进行CDR3谱型和序列分析。结果:小鼠脾细胞24 BV家族均有表达,各TCR BV家族CDR3谱型均呈高斯分布(Gaussian distribution),表明24 BV家族均为多克隆性。EL-4细胞被同时检测到TCR BV10和BV12家族表达,CDR3谱型均呈单峰,两个家族的RT-PCR产物经测序鉴定证实确属TCR序列,且均为框内编码。结论:EL-4细胞存在两套框内重排的TCRβ链,表明其TCRβ链可能存在等位基因排斥"缺陷"现象。本研究为探索T细胞等位基因排斥机制奠定了基础。

丝裂霉素对小鼠淋巴瘤EL-4细胞P21蛋白表达的影响

目的:探讨丝裂霉素(MMC)对小鼠淋巴瘤EL- 4细胞P2 1蛋白表达的影响。方法:采用免疫荧光染色及流式细胞术检测P2 1蛋白表达的时程和量效改变。结果:时程实验研究证实,给予2 m g·L- 1 MMC处理后,EL- 4细胞中P2 1蛋白表达在2～4 8h明显高于对照组(P<0 .0 5 ,P<0 .0 1)。量效实验结果证实,给予1、2和4 mg·L- 1 MMC处理后2 4 h,P2 1蛋白表达与对照组相比明显增高(P<0 .0 1)。结论:MMC能诱导P2 1蛋白表达增高,并存在时间和剂量依赖关系。

IL-12基因转导EL-4细胞对C57BL/6小鼠的肿瘤疫苗作用

应用逆转录病毒构建了IL 12表达载体 ,以研究IL 12基因修饰的肿瘤细胞的肿瘤疫苗作用 ,将其转染EL 4胸腺瘤细胞并研究了该基因导入细胞的抗肿瘤免疫效果。当接种了EL 4 /IL 12转染细胞后 ,在C5 7BL/ 6同系鼠中其基因导入细胞的致瘤性比EL 4 /Wt和EL 4 /Neo组明显减少 (P <0 .0 1) ,在EL 4 /IL 12被排斥后 ,体内试验中实验动物诱发了抗EL 4 /Wt的系统性、保护性免疫 ,51Cr释放测定中 ,获得一个较强的抗EL 4 /Wt和一个较弱的抗同系Lewis肿瘤细胞的CTL活性 ,体内淋巴细胞消除分析的结果提示减少的致瘤性主要依赖于CD4 +,CD8+和NK细胞。这一研究结果提示应用IL 12进行血液肿瘤的治疗是有效的 ,在未来人类癌症的治疗中IL

EL-4荷瘤鼠单链噬菌体抗体库的构建

目的:构建一个EL-4荷瘤鼠的单链噬菌体抗体库,为筛选高特异性和高亲和力的单链抗体做准备。方法:于C57小鼠腋区接种EL-4细胞,待肿瘤长大后,从脾细胞中提取总RNA,RT-PCR技术扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因(VH、VL),用Linker将VH和VL基因连成单链抗体可变区片段(scFv)。双酶切后(Not I、Sfi I)与预备好的pCANTAB5E噬粒载体连接,转化入感受态TG1,构建EL-4荷瘤鼠的单链噬菌体抗体库。随机抽取转化后的20个克隆,用以检测外源DNA的转入情况。结果:PCR扩增出的VH约有340bp和VL约有320bp,scFv的长度约有750bp。转化后的TG1约有1.67×107个菌落,随机挑取20个克隆,双酶切显示五分之一的菌落转化了外源DNA片段,有效库容为3.34×106。结论:成功构建了EL-4荷瘤鼠的单链噬菌体抗体库。

辐射对淋巴瘤EL-4细胞p21基因转录及蛋白表达的影响

目的观察辐射对淋巴瘤EL-4细胞P21蛋白表达及基因转录的影响。方法应用RT-PCR方法检测经辐射诱导的淋巴瘤EL-4细胞中p21基因转录的时程和量效变化,采用流式细胞术检测P21蛋白表达的时程和量效变化。结果 4.0Gy X射线照射后p21基因转录水平立即增高,至照射后4 h达峰值,持续至照射后24 h。4.0 Gy X射线照射后8 h EL-4细胞p21蛋白表达开始增高,24 h达峰值,持续至照后72 h(<0.01)。0.5～6.0 Gy X射线照射后4 h,EL-4细胞p21基因转录水平均高于对照组,其中以4.0 Gy X射线照射后基因转录水平最高,1.0～6.0Gy X射线照射后,EL-4细胞p21蛋白表达均明显增高(<0.05)。结论辐射可诱导淋巴瘤EL-4细胞P21蛋白表达及基因转录,并呈时间和剂量依赖关系。

转录因子Foxo3a高表达对小鼠T淋巴瘤EL-4细胞周期和凋亡的影响

为了研究转录因子Foxo3a高表达对小鼠T淋巴瘤EL-4细胞周期和凋亡的影响,采用电穿孔法将真核表达载体pEGFP-N1/Foxo3a转染小鼠T淋巴瘤细胞系EL-4细胞,并通过聚合酶链式反应和免疫印迹法分别检测Foxo3a mRNA及蛋白表达。转录因子Foxo3a高表达后,采用细胞计数法绘制其细胞生长曲线;采用荧光显微镜法及流式细胞仪定性和定量观察典型EL-4细胞凋亡形态特征、细胞凋亡百分率及细胞周期变化情况。结果表明,转录因子Foxo3a真核表达质粒pEGFP-N1/Foxo3a经酶切鉴定及测序检测序列正确。转染pEGFP-N1/Foxo3a的小鼠EL-4细胞表达Foxo3a mRNA和蛋白水平显著升高。Foxo3a高表达明显抑制EL-4细胞的增殖能力,并使EL-4细胞发生明显G2期阻滞(P<0.001)。Foxo3a基因高表达后,荧光显微镜可以观察到典型凋亡的细胞形态。同时,EL-4细胞凋亡百分率显著升高(P<0.01)。结果提示,Foxo3a高表达可以有效抑制小鼠T淋巴瘤细胞体外细胞增殖,使细胞周期G2时相阻滞,并具有诱导细胞凋亡的作用。

电离辐射对小鼠EL-4淋巴瘤细胞P21蛋白表达的影响

目的阐明电离辐射对小鼠EL-4淋巴瘤细胞P21蛋白表达的影响。方法采用免疫细胞化学方法和流式细胞术检测X射线照射对P21蛋白表达的时程和量效变化的影响。结果时程实验结果显示,离体培养的EL-4细胞经4.0Gy X射线照射后,P21蛋白表达在2～72h(免疫细胞化学方法检测)和8～72h(流式细胞术检测)明显增高(分别为P<0.01、P<0.001)。量效实验结果显示,X射线照射后24h,P21蛋白表达在0.5～6.0Gy(免疫细胞化学方法检测)和1.0～4.0Gy(流式细胞术检测)明显增高(分别为P<0.05、P<0.01、P<0.001)。结论X射线能诱导P21蛋白表达增高,在一定范围内存在时间和剂量依赖关系。

基于两种细胞的卷烟烟气体外免疫毒性评价

为评价卷烟烟气总粒相物(TPM)的体外免疫毒性,选择小鼠淋巴瘤细胞(EL-4细胞)和小鼠巨噬细胞(Ana-1细胞)两种细胞,采用CCK-8法检测肯塔基3R4F参比卷烟烟气TPM染毒后细胞的存活率,采用Luminex液相芯片技术检测细胞上清液中20种细胞因子(FGF-basic、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、KC、IP-10、MCP-1、MIP-1α、VEGF、MIG、TNF-α)的分泌量。结果表明:两种细胞经烟气TPM染毒后,随着染毒剂量的增加,EL-4细胞中GM-CSF、IL-10和VEGF的分泌量均下调;Ana-1细胞中MCP-1、MIP-1α和TNF-α的分泌量均上调;两种细胞中其余17种细胞因子的分泌量无明显变化。不同类型/来源的细胞对烟气的毒性效应有不同的反应,因此采用两种细胞有助于更好地评价卷烟烟气的体外免疫毒性。该方法具有快速、灵敏、高通量等特点,适用于卷烟烟气体外免疫毒性评价。