抗PCV4 Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立可应用于猪圆环病毒4型(PCV4)候选疫苗特异性抗体检测与评价方法,本研究应用PCV4 Cap蛋白作为抗原,以PCV4多克隆兔源抗体作为一抗,优化各反应的最佳条件并建立了针对PCV4 Cap蛋白抗体的间接ELISA方法。最佳条件为2μg/m L PCV4 Cap纯化蛋白,4℃包被过夜,5%脱脂乳封闭60 min,待检血清稀释比例为1∶800,反应条件为37℃、45 min,酶标抗体稀释比例为1∶5000,反应条件为37℃、60 min,底物显色时间为10 min,Cut of f值为0.157,灵敏度可达102400倍。成功建立的抗PCV4Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法具有良好的敏感性、重复性和特异性。可为检测PCV4候选疫苗的特异性抗体水平提供一种精准、高效的方法。

基于Penton蛋白禽腺病毒血清4型间接ELISA抗体检测方法的建立

Penton蛋白是构成禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)衣壳的主要结构蛋白,具备高度保守性与良好的免疫原性。以纯化的Penton蛋白为包被抗原,建立一种基于禽腺病毒血清4型Penton蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,Penton蛋白最佳包被质量浓度为2μg/mL,血清稀释倍数为200倍,酶标抗体稀释倍数为1∶5000,阳性临界值为0.222,敏感性可达到1∶6400,与鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒均无交叉反应,特异性良好,批间批内重复性变异系数均<10%,在100份临床血清中阳性检出率为77%,与商品化试剂盒检出符合率可达98%。综上,建立的ELISA抗体检测方法可以用于禽腺病毒4型临床抗体检测。

禽腺病毒4型Fiber-2蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

旨在制备禽腺病毒4型(FAdV-4)Fiber-2蛋白的单克隆抗体并建立Fiber-2蛋白的定量检测方法。本研究将原核表达的Fiber-2蛋白免疫BALB/c雌鼠,通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,并通过免疫印迹、间接免疫荧光和抗体相加试验筛选杂交瘤细胞株;以制备的单克隆抗体为捕获抗体和酶标检测抗体,通过优化捕获抗体包被浓度和酶标抗体稀释度等条件,建立特异性检测Fiber-2蛋白的双抗体夹心ELISA方法。结果:本研究成功筛选到3株能够稳定传代的杂交瘤细胞株1H2、2A9和3E1,其分泌的抗体均与FAdV-4全病毒具有良好的反应性,可识别不同抗原表位;进一步发现,以1H2为捕获抗体、2A9为酶标检测抗体,能够建立检测Fiber-2蛋白的ELISA方法;该方法具有良好的重复性,批内重复及批间重复试验变异系数均小于10%;敏感性高,Fiber-2蛋白检测限为0.078 ng/μL;特异性好,不与FAdV-4的其他结构蛋白及鸭腺病毒3型的Fiber-2蛋白发生反应。综上,本研究成功制备了3株Fiber-2蛋白单克隆抗体,并建立了定量检测Fiber-2蛋白的双抗体夹心ELISA方法,为后续FAdV-4基础研究和Fiber-2亚单位疫苗研究奠定了物质基础。

血清4型禽腺病毒Fiber蛋白的原核表达及其在抗体检测中的应用

为建立特异的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)血清学抗体检测技术,试验将FAdV-4纤突蛋白基因fiber-2克隆至载体pET-28a中,构建原核表达载体pET-28a-Fiber-2,获得纯化的重组蛋白His-Fiber-2,以纯化的His-Fiber-2作为包被抗原建立检测Fiber-2抗体的间接ELISA方法,对该方法进行特异性、重复性、稳定性、灵敏性试验,并与BioChek FAdV商品化ELISA试剂盒检测结果进行比较。结果显示:建立的ELISA仅与抗FAdV-4阳性鸡血清发生反应,与检测的抗其他病原的血清以及SPF鸡血清均无反应性,批间重复性与批内重复性良好,其变异系数分别在4.345%~6.983%和4.326%~9.391%之间,包被酶标板保存12个月后,变异系数为4.4%~10.0%,其检测灵敏度是间接免疫荧光检测技术的8~32倍,是基于包被GST-Fiber-2蛋白ELISA的2倍;建立的ELISA对FAdV-4灭活疫苗免疫的鸡血清检出率高于BioChek试剂盒,两者对临床感染FAdV-4的鸡血清的检测结果一致。研究表明,试验构建的基于重组蛋白His-Fiber-2的检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法为临床上FAdV-4感染监测以及疫苗的免疫评价提供了技术,具有良好的应用前景。

检测牛IL-4双抗体夹心ELISA方法的建立

为利用牛白细胞介素-4(BoIL-4)的特异性单克隆抗体(MAb)建立检测BoIL-4的双抗体夹心ELISA方法,以多种ELISA方法对7株抗BoIL-4的单抗进一步筛选,得到反应最佳的2株单抗8B7和4A10,以A9表达的重组BoIL-4为阻断剂的阻断ELISA试验中,表明这2株单抗也可识别所构建的细胞系A9表达的重组BoIL-4。以单抗8B7作为包被抗体,以标记了HRP的单抗4A10作为检测抗体建立的双抗体夹心ELISA方法可检测大肠埃希菌、毕赤酵母和Flp-In-293细胞系3种表达系统表达的重组BoIL-4,最低检测限分别为0.25、8和2 ng·mL^(-1),且对A9细胞系上清中表达的BoIL-4检测效果和特异性良好。该研究建立的BoIL-4双抗体夹心ELISA方法为深入研究BoIL-4、开发BoIL-4 ELISA检测试剂盒奠定了基础。

ELISA检测华支睾吸虫病患者血清特异性IgG_4的诊断价值

目的 探讨用ELISA检测华支睾吸虫病患者血清中特异性IgG4 的诊断价值。 方法 用华支睾吸虫成虫可溶性抗原进行ELISA分别检测华支睾吸虫病患者 (76例 )血清中的特异性IgG和IgG4 抗体及日本血吸虫病、并殖吸虫病、囊尾蚴病患者 (分别为 63、3 5、41例 )和健康者 (65人 )血清中的交叉抗体。 结果 检测 76例华支睾吸虫病患者血清中IgG4 的检出率为 93 .42 % ,检测 65例健康者血清中的IgG4 均为阴性 ,分别与检测IgG结果比较差异均无显著性意义 (P均 >0 .0 5 ) ;与其它寄生虫病的交叉反应率 ,IgG4 显著低于IgG ;诊断效率及阳性、阴性预告值分别为 96.45 %、10 0 %和 92 .85 %。 结论 用ELISA检测华支睾吸虫病患者血清中特异性IgG4 具有较高的诊断应用价值。

McAb-ELISA检测丝虫特异IgG_4的应用研究

目的 探讨McAb -ELISA检测丝虫特异IgG4在丝虫感染监测中的应用价值。方法 利用生化免疫技术 ,经细胞融合 ,建立起 7株对IgG4表现为单一反应性的单克隆抗体 (McAb)。以此为探针 ,采用ELISA方法检测丝虫特异IgG4。结果 检测班氏微丝蚴血症者血清的敏感性为 96 3% (10 4 / 10 8) ,测得IgG4的最低限量为 0 0 1ul/ml;检测丝虫病非流行区健康者、肠道线虫感染者、华支睾吸虫感染者和囊虫病患者等血清均呈阴性 ,未出现交叉反应 ,特异性为 10 0 %。经现场应用研究 ,同样获得良好的实用性 ,有效地反映出当地丝虫病流行与感染状况。结论 该技术是监测丝虫感染的理想方法。

ELISA法检测脑囊虫病患者血清特异性IgG及IgG_4的比较

目的 探讨IgG及IgG4在抗囊尾蚴感染中的作用。方法 用分子筛分离提纯猪囊尾蚴囊液粗抗原 ,用ELISA法检测未经治疗和经 1～ 3,4～ 6和 7～ 9疗程治疗的 4组确诊脑囊虫病患者血清中的总IgG和IgG4。结果 总IgG抗体在治疗前组和疗后组之间没有显著性差异 (P >0 0 5 ) ,而IgG4在 2组间有显著性差异 (P <0 0 1)。总IgG在疗后 3组之间没有明显差异 (P >0 0 5 ) ,IgG4抗体在疗后 3组间则有显著性差异 (P <0 0 1)。IgG4的特异性为 98 4 % ,高于总IgG的 94 0 %。结论 IgG4不仅可用于囊虫病诊断 。

间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清4型鸭疫里默氏杆菌抗体的研究

应用超声波裂解法制备的血清4型鸭疫里默氏杆菌(RA)裂解物作为抗原包被酶标板,成功建立了4型RA抗体检测的间接ELISA法。

基于NS4蛋白的蓝舌病病毒间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

旨在建立蓝舌病病毒(BTV)血清学ELISA抗体检测方法,本研究以原核表达并纯化的BTV NS4重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种BTV重组NS4蛋白的间接ELISA抗体检测方法。SDS-PAGE结果显示,获得大小约52 ku的NS4重组融合蛋白,主要在上清中存在,Western blot显示,纯化后的重组蛋白具有良好的抗原性。通过方阵试验进行了ELISA反应条件优化,确定了重组蛋白抗原最佳包被量为3.0μg·孔-1;血清最佳稀释倍数为1∶200,酶标二抗最佳工作浓度为1∶4000,临界值分别为0.29和0.35。上述以NS4蛋白作为包被抗原建立的BTV抗体间接ELISA方法检测敏感性可达1∶1600;批内和批间重复性变异系数均小于10%;检测76份重庆地区牛群血清样品,阳性符合率为98%,阴性符合率为100%。本研究建立的间接ELISA方法为临床BTV血清抗体检测及BTV血清流行病学调查奠定了基础。

基于血清4型禽腺病毒Fiber-2间接ELISA方法的建立

为建立一种快速监测鸡群中血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的方法,本研究通过PCR扩增FAd V-4 AQ强毒株的fiber-2基因截短体(112 bp^1 440 bp),克隆至p ET-32a(+)载体中进行原核表达,以重组表达的Fiber-2蛋白作为包被抗原,经优化反应条件,建立了快速检测FAd V-4的间接ELISA方法,该方法特异性试验结果显示,除FAd V-4外,与其它病原无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法检测血清最低稀释度为1∶12 800,具有较高的敏感性;重复性试验结果显示,该方法批内、批间变异系数均小于10%。该方法对FAd V-4临床感染的阳性血清检出率为100%,与琼脂扩散试验结果完全吻合。本研究建立的以Fiber-2重组蛋白为包被抗原的间接ELISA方法能够用于FAd V-4灭活疫苗免疫后的血清学调查。

间接竞争ELISA方法测定水中2,4-D的研究

以2,4-D-BSA为包被抗原,采用自行制备的2,4-D单克隆特异性抗体6D11建立了水中2,4-D的间接竞争 ELISA检测方法．本研究比较了包被抗原2,4-D-BSA浓度分别为240ng·mL-1、120ng·mL-1和60ng·mL-1的反应体系和竞争反应时间为60min和15min的间接竞争ELISA剂量-反应曲线,确定了当包被抗原浓度为60 ng·mL-1、竞争反应时间为15min时,剂量-反应曲线的IC50值较低．采用上述实验条件分别测定了由PBS缓冲溶液、饮用水、清华大学地下水和圆明园福海地表水配制的2,4-D标准溶液的剂量．反应曲线,发现实际水样的基质效应对检测结果的影响较大;采用实际水样和PBS缓冲溶液配水在含有5％乙醇的PBS缓冲体系中反应的方法,基本上消除了基质效应对检测结果的干扰．采用上述优化试验条件,测定2,4-D浓度分别为0．5mg·L-1、0．125mg·L-1和0．03mg·L-1的加标样品,测定数据的准确度符合痕量有机污染物定量检测对准确度的要求,但是平行样品测定数据之间的变异系数较大,需要进一步改进检测方法,用于实际水样的检测．

检测马疱疹病毒4型抗体间接ELISA方法的建立及应用

为建立检测马疱疹病毒4型(EHV4)抗体的间接ELISA方法,本研究以原核表达的具有型特异性抗原表位的gG蛋白为检测抗原,经条件优化,成功建立检测EHV4抗体的间接ELISA方法,对该方法进行特异性及重复性试验。结果表明,重组4型gG蛋白仅与EHV4阳性血清发生反应,不与马疱疹病毒1型(EHV1)阳性血清发生反应;组内及组间变异系数均小于10%。采用建立的方法与进口试剂盒对不同省份送检的马血清进行检测比较,两者阳性和阴性符合率均在90%以上。本研究建立的间接ELISA方法为检测EHV4抗体及流行病学调查奠定基础。

ELISA与FACS定量方法检测血清AQP4抗体诊断NMO的Meta分析

目的 系统评价酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术（FACS）检测血清水通道蛋白4抗体（AQP4-IgG）对诊断视神经脊髓炎（NMO）的准确性。方法 检索国内外公开发表的相关文献。根据题目、摘要、全文逐步筛选,采用质量评价工具（QUADAS）分析文献质量。采用Meta-Disc1.4与STATA 12.0软件进行Meta分析。根据Meta分析结果综合评价ELISA和FACS方法诊断NMO的准确性。结果 经过严格的纳入及排除标准,最终纳入17篇文献。ELISA和FACS方法合并敏感度分别为0.63（95%CI：0.58～0.68）和0.55（95%CI：0.48～0.61）,合并特异度分别为0.98（95%CI：0.97～0.98）和0.99（95%CI：0.98～0.99）。拟合受试者工作特征曲线（SROC）,得到SROC曲线下面积（AUC）分别为0.9521和0.9542。结论通过ELISA和FACS方法检测AQP-4-IgG对于诊断NMO特异度高,两者都具有较高的诊断效能和准确率。但受纳入研究质量和数量限制,两种方法诊断效能的一致性尚需开展更多高质量研究予以验证。

白色念珠菌H3K4甲基转移酶N端肽段抗体的ELISA检测方法建立

目的建立检测人血清中抗白色念珠菌H3K4甲基转移酶N末端肽段（N—terminal region of histone 3 lysine 4 methyhransferase，Setl-208p）IgG类抗体的ELISA方法，评估其在侵袭性念珠菌病（invasive candidiasis，IC）患者中的早期诊断价值。方法收集IC患者（105例）、定植患者（37例）、细菌感染患者（25例）、其他真菌感染患者（10例）以及健康体检者（200例）血清，用Setl-208p作为包被抗原，血清1：500稀释，以羊抗人IgG-HRP为二抗，测定人血清中相应的抗Setl-208p抗体水平，确定cut-off值并考查方法的敏感度、特异度和准确度。结果以重组Setl-208p抗原建立的ELISA法精密度良好，批内变异系数（coefficient of variation，CV）为5．5％，批间CV为10．4％。重组抗原对血清中相应抗体的阻断率为91．8％，根据ROC曲线，选择吸光度（absorbance，A）值0．40作为cut off值，对IC的诊断敏感度为79．2％，特异度为90％，且与细菌感染及其他真菌感染病人（如曲霉）无非特异交叉反应。此外，IC患者中抗Setl-208p抗体阳性率（76．1％，80／105）显著高于念珠菌定植者抗Setl-208p抗体阳性率（32．4％，12／37）（χ^2=22．9，P〈0．01）。结论建立了检测抗白念珠菌抗Setl-208p抗体的ELISA法，在IC早期诊断中具有潜在应用价值。

丰产鲫败血症病原CSS-4-2的Dot-ELISA快速检测

应用Dot-ELISA法对丰产鲫败血病病原菌豚鼠气单胞菌CSS-4-2菌株的全菌抗原进行检测,其最低检出水平为105 cells/mL.Dot-ELISA法对人工感染CSS-4-2菌株濒临死亡或有明显症状丰产鲫的肝、脾、肾组织匀浆上清液的阳性检出率为97%;而对未显症状丰产鲫的肝、脾、肾组织匀浆上清液的阳性检出率为25%.同时发现当感染浓度较高(≥109 cells·mL-1)时,攻毒3h后在脾脏中就能检出病原菌.

禽腺病毒4型抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种快速检测鸡群中禽腺病毒4型(FAd V-4)的血清学方法,本研究利用纯化的FAd V-4中国流行株作为包被抗原,并对各反应条件进行优化,建立了检测FAd V-4血清抗体的间接ELISA方法。FAd V-4抗原与抗新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒阳性血清均无交叉反应,表明该方法具有较好的特异性;批内和批间重复试验的最大变异系数分别为3.735%和4.373%,显示该方法具有较好的稳定性;利用所建立的ELISA方法对40份来自疑似FAd V-4感染病鸡的血清样品进行检测,检测结果与FAd V-4 PCR检测结果符合率为100%。对我国河南、山东、安徽、山西和江苏等不同地区的676份鸡血清样品进行了FAd V-4流行病学调查,结果显示上述省份均存在不同程度的FAd V-4感染,抗体阳性率在69.3%~89.1%。表明该方法为FAd V-4流行病学调查和防控提供了一种快速有效的检测方法。

4型禽腺病毒抗体间接hexon-ELISA检测方法的建立

以4型禽腺病毒(FAdV-4)的DNA为模板,扩增其六邻体(hexon)部分基因并进行重组表达,以重组hexon蛋白为包被抗原,优化ELISA检测条件,建立了FAdV-4的ELISA抗体检测方法。该方法对FAdV-4阳性血清检测为阳性,对于其他鸡常见病毒,如禽流感病毒5、7、9型,新城疫病毒以及鸡传染性支气管炎病毒阳性血清检测均为阴性;与PCR方法的阳性符合率为83.3%。试验表明,建立的以重组hexon蛋白为包被抗原检测FAdV-4血清抗体的ELISA方法可以用于检测FAdV-4的感染及相关流行病学调查。

抗人IgG_4单克隆抗体用于ELISA法诊断血吸虫病与疗效考核的研究

目的探讨检测特异性IgG4诊断血吸虫病的效果及疗效考核价值。方法采用SEA间接ELISA法检测血吸虫病人血清中的特异性IgG和IgG4抗体及对肺吸虫、肝吸虫病人和健康人血清的交叉反应以及血吸虫病人治疗后不同时期特异性IgG和IgG4抗体的变化。结果血吸虫病人血清中IgG4敏感性为93.02%,特异性为100%,而IgG抗体的敏感性为95.35%,特异性为97.62%,IgG4与IgG无论其敏感性还是其特异性差异均无显著性(P>0.05),与其它寄生虫病的交叉反应,IgG4显著低于IgG且差异显著(P<0.05),血吸虫病人治后6个月IgG4抗体阴转率显著高于IgG(P<0.05),治后12个月IgG4的阴转率与IgG比较差异非常显著(P<0.01)。结论ELISA法检测特异性IgG的诊断效能与IgG4相似,而特异性IgG4抗体可能系一短程抗体,用于评价疗效更具实际应用价值。

Ⅰ群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

利用纯化的 Ⅰ 群禽腺病毒4型重组Hexon蛋白,通过各反应条件筛选,建立了 Ⅰ 群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法.结果显示,抗原最佳包被浓度为1μg/mL;最佳封闭液为1% 牛血清白蛋白;待检血清最佳作用浓度是400倍稀释,37℃孵育60 min;酶标抗体的最佳作用条件为稀释度1:8000,37℃孵育60 min;最佳显色时间为10 min.用所建方法对160只临床鸡只进行检测,同时与拭子PCR检测对比,一致性较好,表明该方法可有效用于临床检测.