非洲猪瘟病毒P54蛋白原核表达及间接ELISA检测方法建立

【目的】建立一种具有良好特异性和敏感性的非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)抗体间接ELISA检测方法。【方法】根据ASFV P54蛋白基因序列进行大肠杆菌密码子优化,将优化后的P54序列克隆到pET-28a(+)质粒中,构建重组质粒pET28a-P54,利用大肠杆菌表达系统表达目的蛋白并用His镍柱进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,以纯化的P54蛋白作为检测抗原进行包被,建立一种间接ELISA方法,对包被条件、封闭液、封闭时间和血清孵育等反应条件进行优化后,对其临界值、特异性、灵敏性和重复性进行验证。【结果】SDS-PAGE结果显示,P54蛋白分子质量为42 ku,纯度在95%以上;Western blotting结果显示,P54蛋白与ASFV阳性血清能产生特异性反应。优化后的ELISA反应条件为:0.3125μg/mL抗原37℃包被1 h,5%脱脂奶粉37℃封闭1 h,1∶800稀释的血清37℃孵育2 h,1∶15000稀释的酶标二抗37℃孵育1 h。该ELISA检测方法仅与ASFV阳性血清产生特异性反应,与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒和乙型脑炎病毒的阳性血清均无明显交叉反应;该方法灵敏性较高,ASFV阳性血清稀释度为1∶3200时仍有明显反应。批间重复和批内重复变异系数均<10%;与商品化试剂盒相比,其阳性符合率为95.45%,阴性符合率为96.05%,总符合率为95.83%。【结论】本研究建立了一种以ASFV P54蛋白为检测抗原的ASFV间接ELISA方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能运用于ASFV的血清学检测,为非洲猪瘟的快速诊断提供更多选择。

基于重组核衣壳蛋白的猪德尔塔冠状病毒间接ELISA检测方法的建立

目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此为抗原,对ELISA反应条件进行优化,并对其特异性、敏感性、重复性进行测试,最终建立ELISA检测方法,并对临床样品进行检测。结果:优化后的抗原包被浓度为2μg/孔,37℃孵育1 h;1%BSA 37℃封闭1 h;一抗稀释最佳浓度为1∶1 600,孵育时间为1 h;酶标二抗最佳孵育时间为60 min。重组蛋白能与猪德尔塔冠状病毒血清发生特异性反应,所建立的检测方法具有优良的敏感性、特异性、重复性。结论:本研究建立了一种针对猪德尔塔冠状病毒的间接ELISA检测方法,为猪德尔塔冠状病毒的抗体水平检测及疾病的防控提供了一种有效的方法。

狐源兔脑炎微孢子虫极管蛋白2(PTP2)的原核表达及间接ELISA方法的建立

为了建立一种特异性好、敏感性高、重复性好的可检测蓝狐兔脑炎微孢子虫病的间接ELISA方法,试验首先从疑似感染兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon.cuniculi)的蓝狐脑组织DNA中扩增PTP2基因,并将其与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建重组质粒pET32a-PTP2,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,将菌体超声后对表达的重组蛋白进行可溶性分析,并纯化目的蛋白;然后以重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件和临界值的确定建立蓝狐兔脑炎微孢子虫的间接ELISA方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验;最后采用建立的间接ELISA方法对28份经常规PCR方法验证已经感染兔脑炎微孢子虫病的蓝狐血清样品进行检测,并计算符合率。结果表明:表达的重组蛋白的分子质量为45.8 ku,且表达产物以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,经纯化杂带明显减少,纯化后的重组蛋白质量浓度为1.55 mg/mL。间接ELISA方法的最佳包被抗原质量浓度为8μg/ml,最佳一抗稀释度为1∶100,最佳封闭液为5%脱脂乳,最佳封闭条件为37℃、1 h,最佳一抗孵育时间为120 min,最佳二抗稀释度为1∶5 000,最佳二抗孵育时间为60 min,最佳显色时间为20 min。阴、阳性血清OD_(450)临界值分别为0.268和0.302。建立的间接ELISA方法检测蓝狐犬瘟热病毒、蓝狐伪狂犬病毒、蓝狐细小病毒阳性血清均为阴性,可检测到稀释度为1∶3 200的蓝狐兔脑炎微孢子虫阳性血清,批内重复与批间重复变异系数均小于10%。用建立的间接ELISA方法检测28份蓝狐血清样品的阳性样品数为23份,与常规PCR方法的符合率为82.14%。说明试验成功建立了一种可检测蓝狐兔脑炎微孢子虫病的间接ELISA方法,该方法特异性好、敏感性高、重复性好,适合在基层推广。

大黄鱼病原菌──溶藻弧菌的ELISA快速检测研究

以灭活溶藻弧菌（０．０５％甲醛，３０℃，８ｈ）制成菌苗，注射免疫实验兔获得抗血清。该 抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等１０株对照菌株无交叉反应。用该抗血清进行溶藻 弧菌ＥＬＩＳＡ检测，其最低检测极限为９７０００ｃｆｕ／ｍｌ。将该方法应用于养殖现场，检测结果为：海 水中溶藻弧菌浓度均低于最低检测限、外观健康大黄鱼肝脏中溶藻弧菌的阳性检出率为 ２０％、患病大黄鱼的阳性检出率为８０％，表明ＥＬＩＳＡ法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌 病，也可以检测无病症带菌大黄鱼。

新霉素ELISA检测方法的建立

目的:比较直接和间接竞争酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)的优缺点,建立新霉素残留ELISA检测方法。方法:利用自制的新霉素多克隆抗体,采用直接竞争和间接竞争ELISA方法检测新霉素残留,并比较两种方法的优缺点。结果:新霉素抗血清和庆大霉素的交叉反应率为2.04%,和卡那霉素的交叉反应率为0.02%,和氨苄青霉素、红霉素、四环素的交叉反应率均小于0.01%。初步测试新霉素间接竞争ELISA法的准确性和回收率。板内误差小于4%,板间误差小于11%,回收率为135.5%～191.3%。直接竞争和间接竞争ELISA方法的检测极限分别为28.58ng/mL和51.74ng/mL,达到了国家对新霉素规定的500μg/kg MRL检测限。结论:建立了直接竞争和间接ELISA吸附检测方法,条件优化更成功的间接竞争ELISA可用于开发新霉素检测试剂盒。

番茄斑萎病毒外壳蛋白原核表达及Dot-blotELISA检测方法的建立

将番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)全长外壳蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中,经限制性酶切分析及测序结果表明插入方向正确且阅读框架无移码突变.将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),SDS-PAGE分析结果证实IPTG可诱导1个分子量约为48 kDa的融合蛋白表达.利用6×His标签单抗和TSWV FoPaTs1多抗证实所表达的蛋白为TSWV外壳蛋白.以纯化的重组外壳蛋白免疫小鼠,制备杂交瘤细胞培养上清单抗,并用杂交瘤细胞培养液上清建立了可靠、有效检测TSWV的Dot-blot ELISA方法.

ELISA及电化学法检测藠头中氨基甲酸酯类农药残留

建立了克百威ELISA检测技术,配合电化学法对200份出口藠头样品进行氨基甲酸酯类农药残留检测。ELISA法对克百威的最低检测限达10-7g/L,检出10例,检出率5﹪;电化学法检测,对乙酰胆碱酯酶抑制率超过60%的样品有7例,检出率3.5%。对比分析检测结果得出2种方法检测结果基本吻合。

间接竞争ELISA检测大豆11S球蛋白和7S伴球蛋白

采用酸沉淀、亲和层析(ConA-Sepharose 4B)等手段,成功地分离纯化了大豆11S球蛋白和7S伴球蛋白,SDS-PAGE检测表明2种蛋白纯度分别达到95%和90%。将纯化的11S球蛋白和7S伴球蛋白分别免疫大白兔获得抗血清,并建立起间接竞争ELISA检测大豆豆粕及其深加工产品中11S和7S抗原蛋白含量的方法。

9例核酸反应性标本与对应ELISA、CLIA法检测HBV的关联分析

目的为保障临床输血的安全性,比较已知酶联免疫吸附试验(ELISA)、ALT阴性合并核酸检测(NAT)反应性标本与对应化学发光(CLIA)法检测HBV的结果,对三种检测方法进行相关性分析。方法对17508例无偿献血者(排除ELISA法初复检公共阳性、ALT阳性等)进行NAT,并对NAT反应性标本进行CLIA检测。结果经核酸检测出9例HBV DNA反应性标本,未检出HCV RNA和HIV RNA反应性标本,其中1例为ELISA法"阴性高值"标本;对应CLIA法HBV"两对半"检测出现2例HBsAg(-)抗-HBs(-)抗-HBc(+)及5例HBs Ag(-)抗-HBs(+)抗-HBc(+)血清型,可能为OBI,2例均无反应性,可能为窗口期标本。结论无偿献血者的现有血液筛查方法 NAT检测和ELI SA法具有互补性,NAT检测可弥补ELISA法检测的"窗口期"问题;NAT与CLIA法检测结果具有一致性;OBI可能是本地区NAT检测HBV DNA献血者的主要类型;对可能影响血液质量的ELISA法"阴性高值"标本的淘汰,会降低输血感染风险。

鱼肠道弧菌间接ELISA快速检测法的建立

为准确、快速诊断鱼肠道弧菌感染所致的海水鱼类全身性败血症,以鱼肠道弧菌为抗原,制备抗鱼肠道弧菌多克隆抗体,建立了鱼肠道弧菌间接酶联免疫吸附检测方法。该方法最佳反应条件为:抗原包被密度为107 cfu/mL,免疫血清稀释度为1∶211。病原菌检测灵敏度为每孔105 cfu/mL。抗血清与迟缓爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌、恶臭假单胞菌、鱼肠道弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、溶藻胶弧菌、秦皇岛弧菌8种水产致病菌的交叉反应结果呈阴性。用该法检测人工感染后的牙鲆和健康牙鲆,在发病鱼的肝脏、肾脏、脾脏、腹水等处检测出病原菌而健康鱼则为阴性。该技术能够准确、快速检测出鱼肠道弧菌。

胸腺素α1间接ELISA测定方法的建立及其在转基因蓝藻中的应用

利用胸腺素α1(Tα1)_小牛血清白蛋白融合蛋白免疫新西兰兔获得的抗体 ,建立了Tα1间接酶联免疫吸附测定法 (ELISA) ,以定量检测转Tα1基因聚球藻7942外源基因表达产物胸腺素α1 ,实验结果表明该方法灵敏度高、专一性强、重复性好 ,可用于转基因微藻Tα1表达量的定量检测 ,同时表明Tα1基因能在聚球藻7942中稳定表达。

坦布苏病毒NS1蛋白的表达及ELISA检测方法的建立

为了建立坦布苏病毒(TMUV)感染鸭群的抗体检测方法,以TMUV NS1的原核表达蛋白质作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,并对该方法进行了检测条件的优化。将TMUV NS1全基因序列克隆至pET-28a(+),利用BL21(DE3)表达NS1蛋白,纯化后其质量浓度为4.16μg·μL^(-1)。通过方阵试验,确定了NS1蛋白的最佳包被质量浓度是100ng·孔-1,检测血清的最佳稀释倍数为40倍。随后对检测条件进行了优化,优化后的结果:抗原的最佳包被条件是4℃作用过夜;酶标二抗的最佳工作条件是稀释5 000倍,37℃作用1h;阴阳血清的临界值为0.278。一系列试验验证了该检测方法具有很强的特异性、敏感性、重复性。对采集自山东各地的80份血清样品进行检测,其检测结果显示,该方法与经典的鸡胚中和试验检测结果的符合率为93.5%以上,且比传统的中和试验更敏感。对TMUV感染鸭群的血清进行检测,描述了TMUV感染后鸭群抗体水平的消长规律,为该病的防治提供重要的理论依据。以NS1蛋白为包被抗原的间接ELISA方法的建立为临床上TMUV的感染提供了一种新的抗体检测方法,尤其是在TMUV早期感染的检测方面有着更为广泛的应用前景。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)直接竞争elisa方法的建立

利用前期制备得到的DON酶标抗原(辣根过氧化物酶标记)以及抗DON抗体,建立检测食品中DON含量的直接竞争ELISA方法。该方法的检测范围1～100ng/mL,灵敏度达0.56ng/mL,半数抑制浓度IC50为10ng/mL;与DON类似物T-2毒素的交叉反应率为12%;玉米淀粉样品回收率在80.2%～91.1%之间,平均批间变异<15%,平均批内变异<3%。

猪轮状病毒性腹泻的ELISA双抗夹心法检测及防治建议

[目的]为猪轮状病毒的针对性防治提供建议。[方法]以不同来源、不同饲养方式下218头猪的粪便为材料,用ELISA双抗夹心法检测其中的轮状病毒(RV)抗原,结合流行病学调查对猪轮状病毒的发病因素及发病特点进行分析。[结果]RV多为隐性感染,且感染率较高。从所取218份样品中共检测出RV阳性50头份,阳性率为22.94%,其中,仔猪170头份,阳性率22.35%,中猪48头份,阳性率25.0%;笼养模式下猪的发病率最低,为17.43%,农户圈养方式下猪的发病率最高,达36.84%。[结论]流行病学调查结果显示,仔猪对RV的感染率高于中猪,采取笼养模式,并对仔猪进行RV防治可降低猪RV的发病率。

J亚群禽白血病ELISA抗体检测方法的建立

本研究分离纯化了具有反应活性的J亚群禽白血病JL_2株gp85表达蛋白,并以其为抗原,开展了相关反应条件、特异性、重复性、敏感性、现地应用以及国外试剂盒符合率等方面的研究,初步建立了J亚群禽白血病ELISA诊断方法。

ELISA、胶体硒和免疫印迹试验检测HIV抗体结果分析

目的复检和确认初筛HIV抗体阳性血清,并对比分析试验结果。方法对初筛阳性血清,用胶体硒和ELISA试验复检,任一复检试验阳性的血清再用western blot(WB)试验确认。结果224份初筛阳性血清经复检84份阳性,WB确认61份HIV-1抗体阳性,不确定10份,阴性13份。以WB结果为标准,ELISA、胶体硒法的阳性符合率分别为84.72%和82.43%。ELISA的敏感性为100%,特异性为96.84%,胶体硒法的敏感性为100%,特异性为95.03%。阳性、不确定和阴性组血清ELISA平均S/CO分别为20.550,2.244和1.434。ELISA和胶体硒法复检同时阳性,在阳性组、不确定组、阴性组分别为100%(61/61),10%(1/10)和0(0/13)。结论胶体硒和ELISA复检可排除大部分初筛假阳性,但两种复检试验均存在一定的假阳性。3种试验的不符情况仅出现在HIV抗体阴性和不确定组,确定HIV感染依赖于WB确认试验。

Screening of Chinese Medicine Resisting Neospora caninum with ELISA

[Objective] The study was to screen the Chinese medicines with good resistance to Neospora caninum. [Method] Healthy Kunming mice pretreated with methylprednisolone for the purpose of immunity decrease were randomly divided into 15 groups, and each mouse was intraperitoneally inoculated with 1.0 ×104 N. caninum. Four hours later, the mice were gavaged with various Chinese medicines. Seven days post-administration, eyeball blood sampling was conducted and the serum was used for antibody level detection with ELISA method. [Result] Four among the 15 Chinese medicines showed lower antibody positive rates. [Conclusion] Scutellaria baicalensis, Stemona sessilifolia, Gastrodia elata and Coptis chinensis could enhance the immunity level of mice infected by N. caninum.

糖萼蛋白的ELISA方法的建立及其血小板活化因子对脑梗死病人筛选诊断的意义

目的建立血小板糖鄂蛋白ELISA方法,并且用于临床检测;SGC,P选择素,GP1 bɑ对脑梗死患者筛选和诊断的意义。方法用biotin标记SZ-2制备biotin-SZ-2,建立ELISA方法测定GC,检测35例健康人,35例脑梗死患者。用流式检测35个脑血栓患者的GP1 bɑ表达和检测25个脑梗塞患者P选择素的表达。结果 SGc ELISA测量范围0.15-5.25 ug/ml,灵敏度:50 ug/l,精密度:批内低、中、高值变异系数分别为8.25%、7.35%和3.99%(n=6),批间分别为9.55%、8.82%和5.48%(n=6);准确度:平均回收率为101.88%。35例脑梗死血清中的SGC浓度:健康对照组SGC浓度为2.04±0.46明显低于脑梗死患者的SGC浓度为;3.4±0.34 ug/ml。两组间比较差异具有显著性(P<0.05)。脑血栓组血小板p选择素(12.6±1.9%)阳性百分率显著高于对照组(6.46±1.50%),脑血栓血小板GP1 bɑ(13.8±2.7)%阳性百分率显著低于对照组(24.31±6.5%)。两组间比较差异具有显著性(P<0.05)。结论 P选择素,GP1bɑ,s GC均可以作为脑梗死患者筛选和诊断的标志物。

乙型脑炎病毒(JEV)ELISA检测方法的建立

目的建立猪乙型脑炎病毒(JEV)抗体ELISA检测方法。方法培养BHK21细胞,接种JEV病毒,制备BHK21正常抗原和JEV特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验。结果正常、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为0.2μg/mL、10μg/mL和1∶20000;正常、特异抗原批内变异系数分别为8.3%和6.4%,批间平均变异系数分别为9.7%和11.5%;检测灵敏度为1∶1280;与猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。可用于猪JEV抗体的检测。

ELISA法检测红曲中的黄曲霉毒素B_1

探讨了红曲中黄曲霉毒素B1的提取方法,发现在传统提取方法甲醇/水溶液(体积比1∶1)直接提取的基础上加氯仿进行液液萃取后,进行ELISA法测定其含量,可以消除假阳性,同时提高了检测灵敏度.在加标质量分数分别为2.5,5,10μg/kg时,加标回收率达到101%～146.8%,方法的重复性较好,变异系数小于13%,样品最低检测限达2.5μg/kg.