口蹄疫血清抗体阴性实验牛筛选方法的探讨

牛口蹄疫疫苗属于国家强制免疫疫苗,牛口蹄疫产品的动物检验是反映该批次产品是否安全有效的重要评判依据。口蹄疫阴性实验牛筛选的速度决定着该批次产品是否能快速投入市场。本实验使用口蹄疫抗体胶体金检测技术对实验牛进行阴阳性初筛,然后用口蹄疫抗体液相阻断ELSIA技术对阴性动物进行复核确认,可以实现快速筛选抗体阴性实验牛,完成口蹄疫疫苗动物实验评估。

酶联免疫法快速测定水产品中呋喃唑酮、呋喃它酮代谢物

采用ELISA方法对水产品中AOZ和AMOZ残留进行检测，结果表明：方法最低检测限为0．3μg／kg，向样品中添加浓度为0．5，1．0，3．0μg／kg三个梯度标准品溶液时，AOZ平均回收率范围为86．8％～96．9％，RSD为7．54％～10．22％，AMOZ平均回收率范围为84．0％～95．4％，RSD为7．03％～12．89％；利用该方法与LC—MS-MS比对试验，样品阴、阳性判断结果一致。

抗人降钙素原特异性单克隆抗体的制备鉴定及初步应用

目的获得抗人降钙素原(procalcitonin,PCT)单克隆抗体,并鉴定其基本特性。方法从NCBI数据库中获得PCT编码序列,以原核表达系统表达PCT重组蛋白,经镍亲和层析柱纯化,获得筛选单克隆抗体的筛选原;综合应用多种生物信息学分析软件预测PCT中潜在的B细胞表位肽,用合成肽对BALB/c小鼠进行免疫,纯化单克隆抗体,通过间接ELISA、Western blot和免疫组化鉴定获得的单克隆抗体。将获得的单克隆抗体作为捕获抗体,经过配对建立检测重组PCT的ELISA体系,并初步对临床血清进行了检测。结果成功获得3株PCT特异性单克隆抗体,分别为2-D7、2-H12和4-H12,亚类分别为IgG1和IgG2a,最高效价为1∶1 024 000,亲和力最高可达到1.3×109L/mol;选取2-D7经Western blot鉴定能够检测重组PCT蛋白,经免疫组化证实能特异性识别甲状腺组织中PCT蛋白,经过配对成功建立了检测重组PCT的ELISA体系,运用建立体系检测临床血清PCT含量时发现正常组与细菌培养阳性组之间具有显著差异。结论成功表达了人PCT重组蛋白,获得了3株高特异性和高亲和力的PCT单克隆抗体,成功建立了检测重组PCT的ELISA体系,并初步用于临床样本检测。

栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(AVNV)卵内的垂直传播途径

急性病毒性坏死病毒已被证实为是一种对养殖栉孔扇贝危害极大的病原体,探讨其传播途径是防控扇贝"大规模死亡症"的前提之一。将亲贝各放在一独立育苗水体内产卵、孵化,并进行幼虫培育。通过春季和秋季室内人工育苗,从40个独立育苗水体中,采获亲贝、卵各23个家系样品,受精卵、D形幼虫、壳顶幼虫各12个家系样品,眼点幼虫2个家系样品。采用间接ELISA法、间接免疫荧光技术和电子显微镜技术对亲贝、卵和发育各期的幼虫进行定性和定位的检测。结果发现,栉孔扇贝的性腺组织中存在病毒粒子,而卵、受精卵及各期发育幼虫体内均未检测到病毒。由此可以判断:AVNV可以感染栉孔扇贝的性腺,但并不存在卵内垂直传播的可能性。

食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇三种检测方法的比较研究

对谷物中DON的检测方法进行了研究,确定了各检测方法的参数,HPLC方法最低检出限为52μg/L,加标回收率为78.92%,相对标准偏差RSD为1.88%,精密度很高;ELISA方法的最低检出限为10μg/L,加标回收率为104%,RSD为5.8%;金标试剂条检测可做出一个标准的颜色反映系列,重现性很好,最低检出限为1000μg/L,加标回收率也很高。金标检测方法简便、快速,适用于现场检测,是未来检测方法的发展方向。

血液保养液对抗-HCV检测影响的探讨

目的探讨CPD血液保养液(以下简称CPD)对抗-HCV检测的影响。方法用CPD以5%的幅度对3种浓度的抗-HCV阳性质控物进行梯度稀释后用ELISA方法进行平行检测,观察S/CO值变化情况。随机抽取抗-HCV阳性和阴性献血者各60名,对其试管样本和血袋管样本做ELISA检测比较。结果阳性质控实验组的S/CO值均随保养液的量增加而逐渐降低;阳性物浓度降低5%,S/CO值均有明显降低(P(0.05);其中阳性物浓度95%的S/CO值降低极显著(P(0.01)。试管和血袋管的抗-HCV阳性样本检测结果有差异,弱阳性样本较为明显。结论CPD对ELSIA检测抗-HCV弱阳性样本影响明显,易造成弱阳性样本的漏检。

血清CA72-4和CA125检测在卵巢上皮性恶性肿瘤中的应用

目的通过血清中肿瘤标志糖蛋白抗原 (CA) 72 - 4和 CA12 5的检测 ,观察其阳性检出率与卵巢上皮性恶性肿瘤的关系。方法卵巢上皮性恶性肿瘤患者 38例和良性肿瘤患者 6 4例的血清样品 ,分别用酶联免疫吸附试验 (EL SIA)和化学发光测定 CA72 - 4和 CA12 5。结果与良性组相比 ,卵巢上皮性恶性肿瘤 ,CA72 - 4、CA12 5和CA72 - 4和 /或 CA12 5的灵敏度分别为 78.9%、6 5 .8%和 89.5 % ,其特异性为 39.1～ 6 8.8% ,卡方检验统计 ,P<0 .0 5差异有显著性 ;在卵巢上皮性肿瘤的分类中 ,CA72 - 4在粘液性和内膜样 ,CA12 5在浆液性和粘液性 ,以及CA72 - 4和 /或 CA12 5在粘液性囊腺癌 (瘤 )的良恶性统计比较 ,P<0 .0 5 ,差异有显著性 ,其中 CA72 - 4在粘液性和内膜样囊腺癌及 CA12 5在浆液性囊腺癌获得较高的检出率 (75 .0～ 89.5 % )。结论 2项肿瘤标志对卵巢上皮性肿瘤的良恶性辅助及鉴别诊断具有一定的应用价值 ,CA72 - 4优于 CA12

乙肝患者血清标志物HBsAg与HBsAb同时阳性的实验分析

目的 探讨乙肝患者血清标志物HBsAg和HBsAb同时阳性原因。方法 采用ELISA方法检测每天受检标本 ,收集HBsAg、HBsAb同时阳性检测结果 ,测定其谷丙转氨酶 (ALT)及总胆红素 (T -Bili)等肝功能项目。结果 HBsAb阳性主要出现在慢性乙肝患者及慢性乙肝携带者 ,“大三阳”与“小三阳”中出现没有明显差异。结论HBsAg、HBsAb同时阳性的模式 ,是由多种原因引起 ,HBsAg亚型双重感染可能是主要原因。

鱼样中阿苯达唑代谢物快速检测研究

建立了鱼类中阿苯达唑代谢物:阿苯达唑砜(ABZSO2)残留ELISA筛选方法,利用乙酸乙酯提取,正己烷去杂质后进行ELISA分析。结果:方法最低检测限为10μg/kg,样品中添加标准物质浓度为20μg/kg、60μg/kg和160μg/kg3个梯度水平,平均回收率范围为88.3%～95.7%,RSD为6.38%～9.88%。结论:实验证明该方法适合鱼类ABZSO2残留筛选。

精神分裂症患者康复过程中血浆白细胞介素-6及其受体的变化

目的探讨精神分裂症患者在康复过程中白细胞介素-6(IL-6)及其可溶性受体(sIL-6R)的动态变化。方法使用ELSIA方法检测45例首发精神分裂症患者治疗前后IL-6、sIL-6R的含量。结果研究组IL-6水平犤(21.2±2.0)ng/L犦较对照组犤(18.1±3.4)ng/L犦增高(t=2.419,P<0.05);sIL-6R水平犤(32.0±14.3)ng/L犦较对照组犤(24.3±14.9)ng/L犦增高(t=2.435,P<0.05);氯氮平治疗后血浆IL-6水平为(23.5±2.4)ng/L较治疗前增高,(t=2.251,P<0.05),IL-6升高幅度与氯氮平药物剂量呈正相关(R2=0.533,P=0.000);治疗后sIL-6R含量为(22.4±17.5)ng/L,较治疗前含量明显降低(t=2.174,P<0.05)。结论精神分裂症患者IL-6及其受体含量增高,精神分裂症患者存在细胞因子的失衡;在康复过程中IL-6及sIL-6R存在不同的变化趋势。

Array360和ELISA法检测轻链在M蛋白病的诊断意义

对50例M蛋白病患者、19例肾病患者血清及尿液中的轻链分别采用Array360速率散射比浊仪及ELISA法进行检测。结果表明，M蛋白病组与正常人组相比轻链含量及。人值均有显著差异（P＜O．05），肾病组与正常人组相比无显著差异（P＞0．05）。采用速率散射比浊法检测血清中游离轻链的阳性率高于采用ELISA法检测尿中游离轻链，前法具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、检测时间短等优点。

抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及其应用

目的制备抗人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)单克隆抗体(mAb),鉴定其基本特性并通过配对检测临床样本血清,对已配对的mAb进行表位鉴定。方法通过已制备的H-FABP抗原和合成肽免疫BALB/c小鼠,常规融合筛选后进行抗体亚型鉴定、效价和亲和力检测,纯化mAb后通过间接ELISA、Western blot法对mAb进行特异性检测;将获得的mAb分别作为捕获和检测抗体,经过配对建立检测重组H-FABP的ELISA体系,并初步用于临床血清检测;采用生物信息学分析设计2段H-FABP表位,通过原核表达获得其短肽并纯化,通过Western blot法对配对的mAb进行表位鉴定。结果成功获得4株抗H-FABP特异性mAb,亚类分别为IgG2a和IgG2b,抗体效价为1∶51 200～1∶1024 000,亲和力最高可达到9.02×109mol/L;经Western blot法和间接ELISA鉴定均能够特异检测重组H-FABP蛋白,经过配对发现mAb 3-H5和1-F10能够检测重组H-FABP,并在其临床血清样本检测中发现正常组和急性心梗组之间H-FABP水平具有显著性统计学差异;通过表位鉴定发现未知表位的mAb 1-F10能够特异识别位点为H-FABP的第86到第133位氨基酸。结论制备了4株高特异性和高亲和力的抗H-FABPmAb,成功建立了检测临床样本血清中的ELISA体系,并对其表位进行了分析鉴定。

ELISA方法检测HBeAg假阳性1例

应用ELSIA法检测乙型肝炎标志物的结果受诸多因素的影响往往出现一些少见模式‘“，分析探讨这种少见模式的原因对正确判读HBVM的结果指导临床是有一定意义的。1资料与方法1．1 一般资料 检测健康体检者，女26岁，身高160cm，体质量57kg，血压110／85mmHg（1mmHg=0．133kpa），心率75次／分，内、外、妇、五官科体察未见异常；心电图、超声检查肝、胆、脾、双肾、甲状腺、胸透均未见异常。曾接种过乙肝疫苗，就诊时近一星期双腿微有酸痛感但未服用过任何药物。

重庆市乙型肝炎病毒血清标志物的动态分析

目的：对重庆市乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）血清标志物进行动态分析。方法：采用ＥＬＩＳＡ法，对人群进行ＨＢＶ血清标志物调查检测。结果：均为常见的九种模式，本组与１９９４年比较变化较小，但单项抗—ＨＢｓ阳性模式的出现率由２１．９％升到２６．２％（χ２＝５．８３３、Ｐ＜０．０５）；本组ＨＢｓＡｇ的阳性率为８．３％，比１９８６年报道的低，男性为９．７％仍明显高于女性的６．５％（χ２＝９．３１０、Ｐ＜０．０５），１０岁～３０岁年龄组的ＨＢｓＡｇ阳性率均在平均阳性率８．３％之上，男女皆如此。流动职业人群感染率高于稳定职业人群（χ２＝６．１９０、Ｐ＜０．０５）。结论：ＨＢＶ感染模式的动态分析具有流行病学意义。

超敏CRP单克隆抗体制备及其ELISA体系的初步建立

目的获得CRP特异性单克隆抗体并建立能够检测超敏CRP(hs-CRP)的双抗体夹心ELISA免疫定量检测方法。方法从NCBI核酸数据库中获得人CRP编码序列并进行密码子偏嗜性改造,利用E.coli表达系统表达CRP重组蛋白。用pET22b-CRP重组质粒表达的CRP重组蛋白(rhCRP-22b)作为免疫原免疫Balb/c小鼠并通过杂交瘤技术制备CRP特异性单克隆抗体,鉴定并筛选能够建立双抗体夹心ELISA系统的抗体配对。以pET28a-CRP重组质粒表达的CRP重组蛋白(rhCRP-28a)作为标准品,对该系统线性范围、灵敏度、精密度和准确度(回收试验)进行分析和评价。结果获得5株CRP单克隆抗体,筛选得到2株单克隆抗体可用于hs-CRP的ELISA免疫检测。通过鉴定2株抗体具有良好的效价和特异性。ELISA检测系统线性范围为0～166 ng/ml,灵敏度为5.2 ng/ml,批内CV≤6.43%,批间CV≤5.93%,平均回收率为98.9%,与Orion公司hs-CRP诊断试剂检测结果有良好的可比性。结论本研究制备了高效特异的CRP单克隆抗体并建立了能够检测hs-CRP的双抗体夹心ELISA方法,该方法灵敏度、精密度和准确性良好,能够达到hs-CRP的检测要求,为进一步研发和建立具有自主知识产权的免疫检测试剂盒及其他检测方法体系奠定了良好的基础。

包被稳定剂和酶结合物稳定剂稳定效果的初步观察

包被稳定剂和酶结合物稳定剂稳定效果的初步观察薛茵，王金龙在ＥＬＩＳＡ检测中，为了能使予包被的抗原在较长时间内保持活性，常将予包被的酶标板真空干燥后密封保存。这样做的缺点是耗时。另一种常用的试剂是酶标记抗体，以ＨＲＰ标记的抗体为多。这种标记抗体极易失活...

猪圆环病毒2型Cap蛋白特异性纳米抗体的原核表达研究

为利用大肠埃希菌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白特异性纳米抗体,并对其抗原结合活性进行鉴定,以Cap蛋白特异性纳米抗体基因(vhh cap)序列为模板,利用Primer 5.0软件设计一对通用vhh cap特异性扩增引物,通过PCR方法扩增vhh cap基因片段,经双酶切处理后分别克隆到pCold-SUMO和pET-32a(+)载体上,转化宿主菌E.coli BL21(DE3),使用IPTG进行诱导表达,表达产物通过Ni 2+亲和层析柱进行纯化,经SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,同时使用ELISA方法对两种载体表达的纳米抗体ELISA效价进行检测和对比分析。SDS-PAGE结果显示pCold-SUMO和pET-32a(+)载体均能实现VHH cap纳米抗体重组蛋白的原核可溶性表达,Western blotting表明纳米抗体重组蛋白可通过6×His-Tag进行检测;ELISA结果显示pCold-SUMO载体表达的纳米抗体重组蛋白效价为1∶500,ELISA效价明显高于pET-32a(+)载体表达产物。PCV2 Cap特异性纳米抗体成功表达为PCV2检测及治疗用新型的抗体开发奠定了基础。

基于新型小鹅瘟病毒VP3基因间接ELISA快速检测方法的建立

应用PCR方法扩增了新型鹅细小病毒(NGPV)的VP3基因,然后将其克隆到原核表达载体中,获得重组质粒p GEX-VP3。将p GEX-VP3转化到DH5α感受态细胞中,诱导表达后分别用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定。然后以表达的VP3蛋白作为抗原,包被ELISA板。分别对包被抗原的浓度、抗原封闭条件、血清的孵育条件、酶标二抗的孵育条件等进行优化,最终成功建立间接ELISA。VP3蛋白的包被稀释度为1:800,4℃包被过夜,5%脱脂乳4℃封闭过夜,血清稀释度为1:120,酶标二抗稀释度为1:1000,孵育时间为30min。此方法有良好的重复性及特异性,为临床检测新型细小病毒感染以及疫苗评价提供了参考方法。

牛副流感3型NP融合蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为原核表达牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)NX49株截短NP融合蛋白并以此建立间接ELISA检测方法,本研究采用RT-PCR方法扩增了BPIV3截短NP蛋白基因序列并克隆至p ET-28a中进行诱导表达,纯化后产物进行Western blot分析。以重组蛋白作为包被抗原,建立并优化检测BPIV3抗体的间接ELISA方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证。结果成功表达出截短的NP重组蛋白,该重组蛋白具有良好的反应原性。间接ELISA优化结果如下:抗原包被浓度为4μg/m L,37℃包被1 h后4℃过夜,待检血清以1:80倍稀释37℃孵育1 h,5%脱脂乳37℃封闭1 h。二抗以1:5 000倍稀释37℃孵育1 h,TMB显色时间为15 min。以该蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法其特异性为97.4%,敏感性为95.3%,批内、批间检测结果变异系数均小于10%。本试验成功建立检测BPIV3抗体的间接ELISA方法,该方法具有较强的特异性、良好的重复性及敏感性,为开展牛呼吸道疾病综合征的流行病学调查、实验室诊断奠定了基础。