EMA-LAMP方法快速检测死/活的食源性沙门氏菌

建立应用叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide,EMA)与环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)相结合检测沙门氏死/活菌的方法。该方法具有快速、方便和灵敏度高等优点,以SYBRGreenI为显色剂、恒温65℃、反应1h便可得出检测结果。该检测系统中,得到241bp的目标片段和类似于梯子状的系列条带。该方法的检测限为10-10gDNA/管,是EMA-PCR方法的1%。本方法实用性强,具有普遍的应用意义。

EMA-LAMP方法快速鉴别检测单增李斯特菌

作者建立一种将叠氮溴化乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)结合环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的新分析方法(EMA-LAMP),快速鉴别检测单增李斯特菌。通过对单增李斯特菌hly基因的六个区域设计4条LAMP特异性引物,EMA-LAMP在63℃下反应1 h,检测单增李斯特菌的死活细胞。结果表明,在浓度为2.0×108CFU/mL的单增李斯特死菌悬液中,使EMA激活光解进入死细胞中且与DNA结合的最佳曝光时间至少为20 min,不抑制活菌细胞DNA的LAMP扩增的最大EMA质量浓度为10μg/mL,而抑制死菌细胞DNA的LAMP扩增的最小EMA质量浓度为4.0μg/mL;活菌细胞的检出限为20 CFU/mL。

EMA-LAMP方法快速检测鉴别副溶血性弧菌

建立将DNA染料EMA(ethidium bromide monoazide)结合环介导等温扩增技术(loop-mediated isother-mal amplification,LAMP)的方法(EMA-LAMP),用于检测鉴别副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)死/活菌细胞。针对副溶血性弧菌不耐热溶血素基因tlh(thermolabile hemolysin)特异性序列的6个位点设计4条引物及2条环引物,进行检测。结果表明,浓度为8.0μg/mL或更高浓度的EMA,至少经25 min的曝光处理,能够有效抑制浓度为1×108cfu/mL的副溶血性弧菌死细胞的扩增,而对用相同浓度EMA处理的副溶血性弧菌活细胞扩增没有影响。经EMA处理,含有不同比例的副溶血弧菌死细胞和活细胞的混合液中,活菌的最小检测限为1.0×102cfu/mL。EMA-LAMP方法比EMA-PCR方法区分死活细胞中的活细胞更为有效,是一种能够快速、灵敏且更为有效鉴别副溶血性弧菌死活细胞的新方法。

BCAC-EMA-Rti-LAMP非预增菌快速检测鱼肉污染活的副溶血弧菌研究

【目的】随着人民物质生活水平的不断提高,对食品质量要求也愈来愈高,食品安全现如今已经成为影响人类生命健康财产安全的重大公共卫生问题。食源性致病菌是引起食品安全中毒事件的主要原因,而副溶血弧菌主要污染海产品从而引起急性肠胃炎。因此,快速有效地检测筛查污染的海产品,是有效防控副溶血弧菌食源性疾病暴发的必要条件。【方法】研究以副溶血弧菌特异性tlh基因设计合成引物,以Midori Green为核酸荧光染料,构建了一种副溶血弧菌实时荧光环介导等温扩增(Rti-LAMP)检测技术,并联合蒙脱石封闭的活性炭(BCAC)、叠氮溴化乙锭(EMA)对样品前处理,建立了一种非预增菌快速检测鱼肉污染活的副溶血弧菌方法。【结果】Rti-LAMP检测纯培养副溶血弧菌灵敏度达1 CFU/反应,1 h以内完成。模拟污染1 g鱼肉样品,经4 g BCAC吸附和6μg/mL EMA终浓度处理细菌样品,提取细菌DNA用于Rti-LAMP扩增反应,最低检出限为6 CFU/g活的副溶血弧菌,整个检测过程需约5 h。对市售33份新鲜海鱼样品检测,BCAC-EMARti-LAMP检测出3份阳性样品,BCAC-Rti-LAMP为6份阳性样品,而相应国标检测法为2份阳性样品。【结论】研究表明,BCAC-EMA-Rti-LAMP可以有效检测区分样品中活的副溶血弧菌污染,较国标检测法更快速、灵敏,有望作为鱼肉副溶血弧菌污染的一种快速筛查检测方法。

牛奶中活沙门氏菌BCAC-EMA-Rti-LAMP快速检测方法的研究

研究以沙门氏菌的invA基因序列设计特异性引物,结合蒙脱石封闭的活性炭(BCAC)吸附、叠氮溴化乙锭(EMA)前处理牛奶样品,建立了一种基于实时荧光环介导等温扩增法(Rti-LAMP)非预增菌快速检测牛奶中低浓度活沙门氏菌的方法。以每份25 mL牛奶样品,人工模拟不同浓度沙门氏菌污染,用4.0 g蒙脱石封闭的活性炭吸附处理样品,然后对回收精制的细菌样品用4.0μg/mL EMA终浓度作用处理,提取细菌样品DNA用于RtiLAMP扩增检测,该方法检测灵敏度为1×10^1CFU/mL活沙门氏菌,整个检测过程约5 h。以沙门氏菌国标检测法为参照,采用BCAC-EMA-Rti-LAMP检测生鲜牛奶样品27份,结果显示:2种方法均检测到同一份沙门氏菌阳性牛奶样品,而BCAC-EMA-Rti-LAMP另检测到3份牛奶样品沙门氏菌阳性。研究表明,建立的BCAC-EMARti-LAMP检测方法较国标检测法更灵敏、快速,可用于牛奶沙门氏菌污染的快速检测。