柑橘溃疡病菌EMA-PCR快速活体检测技术的建立

传统PCR方法不能诊断柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri Gabriel)的死活状态,往往导致假阳性检测结果。本研究将特异性核酸染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与PCR技术结合,旨在建立柑橘溃疡病活菌的快速检测技术。根据柑橘溃疡病菌独有的保守蛋白基因设计特异性引物扩增出278bp的靶带,PCR反应的检测下限为25个细胞/25μL或2.75pg/25μL。EMA-PCR结果表明:当卤钨灯曝光时间1min,EMA终浓度为1.0mg/L时,能有效抑制1.0×108 cfu/mL死菌的扩增;当EMA的浓度小于30mg/L时,EMA对上述相同浓度活菌靶基因的扩增没有明显的抑制。EMA-PCR对死活混合菌的扩增表明,活菌数在6.875×101～6.875×105 cfu/PCR范围时,荧光强度与混合体系中活菌的对数值有线性关系。基于以上建立的EMA-PCR活体检测技术,对疑似带病柑橘材料进行检测,结果发现能降低柑橘溃疡病菌检测过程中的假阳性,有望为柑橘溃疡病的检疫检验提供更科学的技术手段。

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EMA-PCR检测技术的建立

肠出血性大肠杆菌O157∶H7是一种重要的人畜共患传染病病原菌。为建立一种特异、灵敏的O157∶H7新型检测技术,以O157抗原基因(rfbE基因)为模板设计特异性引物,利用叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种快速、有效的O157∶H7活菌EMA-PCR检测方法。结果显示:EMA-PCR可从rfbE基因阳性菌株CVCC248和两株临床分离菌株cd0912、cd0803中扩增出大小为495 bp的特异性条带,检测灵敏度可达12 CFU/mL。经EMA处理,从含有1%～100%O157∶H7 CVCC248活菌混合悬液制备的DNA中均可扩增出目的片段。因此,成功建立了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的EMA-PCR检测方法;该方法可避免因分析的样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,检测的准确性和真实性较传统PCR大大提高。O157∶H7 EMA-PCR技术的建立为O157∶H7的临床诊断提供了新的方法,具有重要的实际应用价值和良好的应用前景。

应用EMA-PCR检测沙门氏菌活菌的研究

根据沙门氏菌保守的侵袭蛋白A(invasion protein A,invA)基因序列设计特异性引物,对实验菌株进行PCR检测,结果只有沙门氏菌能扩增出大小为285bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带。本研究利用EMA能穿过死细菌的细胞膜并在光激活的作用下能与基因组DNA共价结合,从而能抑制死菌DNA进行PCR扩增的特性,建立了一种快速、有效的检测沙门氏菌活菌的EMA-PCR方法,从而避免了因分析的样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果。该方法较传统PCR大大提高了检测的准确性和真实性,检测灵敏度可达11CFU/ml。

EMA-PCR检测金黄色葡萄球菌活菌的方法

根据金黄色葡萄球菌(SA)耐热核酸酶编码基因(nuc基因)设计特异性引物,对试验菌株进行PCR检测,结果显示,金黄色葡萄球菌扩增出大小为480bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带。由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,从而使检测结果往往出现很高的假阳性。本试验利用EMA能穿过死细菌的细胞膜并在光激活的作用下能与基因组DNA共价结合,从而能抑制死菌DNA进行PCR扩增的特性,建立了一种快速、有效的检测金黄色葡萄球菌活菌的EMA-PCR方法,较传统PCR大大提高了检测的准确性和可靠性,该方法检测灵敏度可达15CFU/mL。

肠炎沙门氏菌EMA-PCR检测方法的建立

将荧光染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide,EMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测技术相结合,用于肠炎沙门氏菌活菌的检测。实验参数优化结果表明,当EMA终质量浓度50μg/mL、曝光时间10 min时,可以抑制约107 CFU/mL肠炎沙门氏菌死菌DNA的扩增;活菌灵敏度检测结果显示,EMA-PCR方法检测限与单一PCR方法一样均为27.5 CFU/mL,说明EMA处理既不会影响活菌DNA的扩增也不会影响PCR方法的灵敏度。利用EMA-PCR方法检测死活混合菌液时发现,添加EMA的实验组DNA条带亮度会随着活菌比例的降低而变暗,且当样品中全是死菌时,没有目标条带出现;而不添加EMA的对照组DNA条带亮度没有变化,当样品中全是死菌时,目标条带依然清晰可见。说明添加EMA可以达到区分死活菌的目的,EMA-PCR方法只检测样品中的活菌,避免了死菌DNA造成假阳性的可能性。

肠毒性大肠埃希菌肠毒素LTa基因特异性EMA-PCR检测方法的建立

由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,为避免因样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,本研究根据肠毒性大肠埃希菌(ETEC)不耐热肠毒素LTa基因设计特异性引物,利用叠氮溴乙锭(EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法。肠毒性大肠埃希菌CVCC196、CVCC197、CVCC200均能扩增出大小为438bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带。经EMA处理,除了完全死菌组外,含有10mL/L～1 000mL/L活菌的混合悬液均可扩增出目的片段。因此,成功建立了一种快速、有效的检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法,该方法较传统PCR大大提高了检测的准确性,灵敏度可达19cfu/mL。

副溶血弧菌EMA-PCR检测技术的建立

PCR技术被广泛应用于副溶血弧菌的检测中,但传统的PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,往往使检测结果出现较高的假阳性。因此,将叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide bro-mide,EMA)与PCR技术结合,建立一种快速、准确的副溶血弧菌检测方法。以dnaJ基因为检测副溶血弧菌的靶基因,分别用副溶血弧菌的纯培养细胞及其基因组DNA作模板进行PCR检测,灵敏度分别为2.5×104 CFU/mL和6×102 fg/μL。在检测样品前处理过程中加入EMA,当EMA的浓度小于5 mg/L时,EMA对活菌靶基因的扩增没有明显的抑制;而终浓度为2 mg/L的EMA,能有效抑制1×108 CFU/mL副溶血弧菌死菌的扩增。活菌和死菌混合体系的PCR结果表明,EMA-PCR能有效降低副溶血弧菌检测过程中的假阳性。

EMA-PCR方法快速检测铜绿假单胞菌活菌研究

目的探讨将叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)选择渗透性与PCR技术相结合(EMA-PCR),建立有效快速检测铜绿假单胞菌活菌的方法。方法以铜绿假单胞菌oprI基因为PCR检测靶基因,纯培养物提取模板进行PCR,检测PCR灵敏度、EMA使用浓度和曝光时间优化试验。结果 PCR检测灵敏度为3×103 CFU/mL;曝光处理时间为10 min;EMA浓度≤5μg/mL对活菌DNA扩增没有明显抑制,终浓度为1μg/mL EMA能有效抑制3×106 CFU/mL死菌扩增;1%活菌混合体系检测结果阳性。结论 EMA-PCR方法能有效快速检测铜绿假单胞菌活菌,能避免PCR检测可能造成的假阳性结果。

EMA-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的将叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与PCR技术相结合,建立一种有效、快速检测活肠出血性大肠杆菌O157∶H7的方法。方法以rfbE为PCR检测靶基因,O157∶H7培养物经EMA处理后制备模板进行PCR检测,并对EMA使用浓度、作用时间等进行优化。结果不抑制O157∶H7活菌PCR扩增的最大EMA浓度为10μg/mL;抑制2×107 CFU/mL死菌PCR反应的最小EMA浓度为0.5μg/mL;该法对O157∶H7检测的灵敏度为2×104 CFU/mL,结果显示能检出混合体系中含有的1%的活菌。结论 EMA-PCR技术能有效检测活的O157∶H7,在突发公共卫生事件的快速检测中具有良好的应用前景。

EMA-PCR技术快速鉴别死活腺病毒的初探

目的探讨采用叠氮溴化乙锭(EMA)联合聚合酶链反应(PCR)快速鉴别死活腺病毒的方法。方法将不同稀释度的病毒接种至生长良好的单层细胞上,通过细胞病变效应(CPE)的发生情况计算病毒滴度;将3种腺病毒和新城疫鸡瘟病毒分别制备成106 PFU/mL的母液并梯度稀释备用,提取DNA后用PCR扩增后进行凝胶电泳,观察目的片段的扩增结果;分别用0μg/mL、70μg/mL、120μg/mL和150μg/mL的EMA处理灭活后的腺病毒,提取DNA进行PCR,观察目的片段的电泳结果;用120μg/mL的EMA处理107 PFU/mL、106 PFU/mL、105PFU/mL、104 PFU/mL、103 PFU/mL的腺病毒,观察PCR和凝胶电泳结果。结果 104 PFU/mL及以上滴度的病毒DNA PCR后得到阳性条带,其他滴度的病毒DNA PCR后未检测到阳性条带;3个型别的腺病毒(共8个分离株)的DNA均扩增出目的条带,新城疫鸡瘟病毒的DNA未扩增出目的条带;120μg/mL及150μg/mL的EMA抑制灭活腺病毒DNA扩增,未得到阳性条带;120μg/mL EMA不影响107 PFU/mL、106 PFU/mL、105 PFU/mL的腺病毒活病毒DNA扩增,得到阳性条带。结论本研究证实EMA-PCR方法可快速鉴别死活腺病毒,能有效避免单纯PCR检测腺病毒产生的假阳性结果。

EMA-PCR技术检测金黄色葡萄球菌活菌

目的将叠氮溴化乙锭(Ethidium monoazide bromide,EMA)与聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)相结合,建立一种快速、有效检测金黄色葡萄球菌活菌的方法。方法用EMA处理金葡菌培养物后提取模板,以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶编码基因(nuc基因)为靶基因进行PCR反应,并对EMA浓度和曝光时间等条件进行优化。结果当检测2×106CFU/ml的金黄色葡萄球菌时,能有效抑制死菌DNA扩增的EMA最小浓度为0.3μg/ml,对活菌DNA扩增没有明显抑制的EMA最大浓度为2μg/ml;经EMA处理后,从含有1%金黄色葡萄球菌活菌混合悬液制备的DNA中可扩增出目的片段。结论 EMA-PCR能有效检测金黄色葡萄球菌活菌,在临床医学和公共卫生领域检测中具有重要的实用价值。

EMA结合PCR技术有效鉴别副溶血弧菌死活细胞

将EMA（Ethidium monoazide）选择渗透性和PCR技术相结合,建立检验副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus死活细胞的EMA-PCR新方法.研究表明,25μg/mL或更高质量浓度的EMA可以抑制2.0×107CFU/mL的副溶血弧菌死细胞DNA的扩增,未经EMA处理的对应样品PCR反应呈阳性;而用相同浓度EMA处理2.0×107CFU/mL的活细胞菌悬液能扩增出目的产物.同时,对EMA处理中卤素灯的曝光时间进行优化,确定EMA处理的最佳曝光时间为5~10 min.结果证明,该方法是一种快速有效的检测死活细胞的新方法,能有效避免PCR检测假阳性结果的出现.

基于DNA染料EMA的RT-PCR技术定量检测海产品中病原性副溶血弧菌活细胞

将一种DNA染料叠氮溴化乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)技术相结合,建立一种能选择性定量检测牡蛎中trh阳性副溶血弧菌活细胞的新方法。结果表明:使EMA成功插入死细胞DNA并且光解溶液中游离EMA的最佳曝光时间为20min;不抑制副溶血弧菌活细胞DNA扩增的最大EMA质量浓度为2.0μg/mL;完全抑制热致死细胞DNA扩增的最小EMA质量浓度为1.0μg/mL;人工污染牡蛎样品,不经过富集,在2.0×103～2.0×107CFU范围内细胞数的常用对数值与Ct值之间呈严格的负相关性,并且纯培养与人工污染牡蛎样品的RT-PCR检测限均为2×103CFU,即人工污染牡蛎样品的RT-PCR检测灵敏度为每克牡蛎样品400个活细胞;冻融实验表明,在温度低于55℃的水浴中对冷冻海产品进行解冻时,冻融过程对副溶血弧菌活细胞几乎没有影响。该方法是一种快速、灵敏且能有效鉴别并定量检测病原活细胞的新方法。

食品中微生物检测新技术研究进展

食品微生物是影响食品安全的重要因素,由食源性致病菌引起的病例越来越多。但致病菌往往共存于复杂的生物体系中,且数量极少、致病性高,因此,微生物检测方法要有高灵敏度、特异性以及较短的分析时间,现有的成熟检测技术尚难以实现对微生物进行实时、准确、快速的检测,因而许多新的检测方法已成为研究的热点。从微生物检测的角度出发,对逆转录聚合酶链式反应、叠氮溴化乙锭聚合酶链式反应、可视化基因芯片、荧光标记噬菌体等近年来出现的新型检测技术进行论述,并分析各自的优缺点。

EMA实时荧光PCR技术检测食品中单核增生李斯特活菌方法研究

目的利用叠氮溴化乙錠(EMA)实时荧光PCR技术,建立直接检测食品中单增李斯特活菌的方法。方法根据单核李斯特菌inlA基因设计特异性引物和探针。用不同EMA浓度、不同光照次数优化样品前处理条件。用平板计数法验证该方法的检出限及对死菌的抑制率。用35株单增李斯特菌、25株非单核李斯特菌、92株非李斯特菌验证该方法特异性。用添加了不同剂量的单增李斯特死菌、活菌及金黄色葡萄球菌的15件饮料,15件熟肉制品进行模拟实样检测。结果单增李斯特活菌EMA实时荧光PCR方法的Ct=(38.46-3.30)×log(菌量)(R2=0.999)。最低检测的活菌浓度为55cfu/反应。对死菌DNA抑制效率≥99.98%。35株单增李斯特菌Ct值最低16.21,最高29.38,而25株非单单增李斯特菌、92株非单增李斯特菌的Ct值均大于35或无Ct值。重复试验Ct值变异系数小于5%。30件模拟实样单增李斯特菌的检测结果与常规方法完全一致。且EMA实时荧光PCR方法检出时间仅需10h左右,而常规分离培养方法需要5~7d。结论 EMA实时荧光PCR检测技术是一种快速、简便、特异性强、灵敏度高、仅检测单增李斯特菌活菌的有效方法,可作为食品中检测单增李斯特活菌的方法推广使用。

乳腺癌患者外周血EMA和EGP-2mRNA的表达及其临床意义

目的探讨上皮膜抗原(EMA)和表皮糖蛋白基因(EGP-2)在乳腺癌患者外周血中的表达及其与肿瘤微转移的关系。方法采用RT-PCR方法检测53例乳腺癌患者(乳癌组)和24例乳腺良性疾病患者(良性病组)EMA和EGP-2 mRNA在外周血中的表达,并分析其与临床指标之间的关系。结果乳癌组外周血EMA和EGP-2 mRNA的表达率分别为33.96%和28.30%,而在良性病组外周血表达率分别为0和4.17%,差异均有统计学意义(P<0.05)。EMA和EGP-2 mRNA的检出率与腋窝淋巴结转移、TNM分期等临床参数呈正相关;EMA和EGP-2 mRNA联合检测敏感度和准确性在乳腺癌组分别为52.83%和66.23%,相对于EPG-2 mRNA单项检测敏感度及准确性有明显升高,但与EMAmRNA无统计学差异。结论EMA和EGP-2联合检测时准确性明显升高,故两者可作为标志物检测乳腺癌患者外周血微转移,有可能对乳腺癌的疗效和预后判断有意义。

饲料及其原料中沙门菌快速检测方法的比较研究

为了探索饲料及其原料中沙门菌的检测方法,对河南省饲料企业采集239份饲料及其原料,分别采用常规培养法、PCR法、EMA-PCR法、Romer快速检测法检测沙门菌,并对检测结果进行比较.结果显示:常规培养法检出7份阳性,PCR法检出9份阳性,EMA-PCR法检出7份阳性,Romer快速检测法检出6份阳性;同常规培养法相比,PCR法容易产生假阳性结果,Romer快速检测法容易出现假阴性结果,EMA-PCR法与常规法吻合率为100%,能够快速、准确地检测饲料及其原料中沙门菌.

荧光染料EMA在实时荧光PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用

将荧光染料——叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时荧光-聚合酶链式反应(real-time poly-merase chain reaction,RT-PCR)技术相结合,对其在RT-PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用进行研究。纯培养条件下,在2.2×102～2.2×107CFU范围内细胞数的常用对数值与Ct值之间呈严格的负相关性,并且不添加EMA时的检测灵敏度(22CFU)略大于添加EMA(2.2×102CFU)时的检测灵敏度;人工污染牡蛎样品,利用RT-PCR和EMA RT-PCR以及平板计数法分别进行副溶血弧菌定量检测,结果表明EMA RT-PCR更接近于平板计数的结果,单纯RT-PCR定量的结果偏大;在采集的45份海产品样品中,不经富集培养,利用EMA RT-PCR方法仅有一份牡蛎样品呈阳性,牡蛎样品污染程度为114CFU/g。该方法能够快速、灵敏、准确地进行海产品中致病性副溶血弧菌活细胞的定量检测,具有很好的应用价值。

EMA-qPCR检测空肠弯曲活菌方法研究

目的建立一种快速定量检测食品中“活的”空肠弯曲菌的技术方案。方法通过对103 CFU/m^10^6CFU/mL的空肠弯曲菌进行叠氮溴化乙锭(EMA)的前处理研究,建立区分死菌与活菌的EMA前处理技术,与荧光定量PCR检测弯曲菌的方法相结合,建立EMA-qPCR组合检测技术,并进行模拟食品标本的验证。结果空肠弯曲菌在103 CFU/mL^10^6CFU/mL内,EMA的最优使用浓度为5μg/mL,5μg/mL的EMA-qPCR可区分出死/活空肠弯曲菌混合物中的死菌和活菌,并成功应用于模拟食品标本中“活的”空肠弯曲菌的检测。结论EMA-qPCR可作为快速定量检测样本中“活的”空肠弯曲菌的方法。

EMA结合实时荧光PCR方法检测单核细胞增生李斯特氏菌

建立叠氮溴化乙锭(EMA)结合实时荧光PCR(qPCR)方法检测单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)活菌。以李斯特溶血素O(LLO)基因hly设计引物、TaqMan探针,用李斯特属典型菌、沙门氏菌等56株致病菌株验证特异性,不同质量浓度EMA处理进行qPCR检测。尝试脱氧胆酸钠溶液(SD)强化抑制效果,73份不同的人工污染食品、环境样本(卤鸡肉、牛奶、肉馅、垃圾渗滤液)测试实用性。结果表明,引物探针准确检测L.monocytogenes,对其他菌株无特异性扩增。EMA最适质量浓度2.5μg/mL,经过15 min光激活与死菌DNA共价结合明显抑制了扩增,方法检出限为150 CFU/mL。SD处理L.monocytogenes活菌Ct值增加。与传统培养法比较,EMA-qPCR方法检测100%准确,操作简单、省时高效,在食品、环境方面应用前景广阔。