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人工合成的脑心肌炎病毒VP1表位基因在大肠杆菌中的表达与抗原性测定 被引量:5
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作者 韩研妍 姜平 +1 位作者 顾小雪 李玉峰 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期100-103,共4页
在分析脑心肌炎病毒VP1蛋白抗原表位基础上人工合成一段含VP1抗原表位双链DNA序列(150 bp),克隆于原核表达载体pGEX-6p-1,经酶切鉴定后转化大肠杆菌(E.coli)BL21感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。经过GSTr... 在分析脑心肌炎病毒VP1蛋白抗原表位基础上人工合成一段含VP1抗原表位双链DNA序列(150 bp),克隆于原核表达载体pGEX-6p-1,经酶切鉴定后转化大肠杆菌(E.coli)BL21感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。经过GSTrap FF亲和层析柱获得纯化蛋白,经SDS-PAGE电泳显示相对分子质量为30 800。以该纯化蛋白免疫家兔,获得效价分别为1∶25 600和1∶1 600的抗血清。W estern-b lot结果显示该融合蛋白与经过空载体pGEX-6p-1表达的GST蛋白孵育的抗血清反应后有明显的特异性条带。结果表明:脑心肌炎病毒VP1蛋白抗原表位区150 bp编码基因在E.coli中获得正确表达,纯化后的蛋白具有抗原性。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 vp1蛋白抗原表位 原核表达 抗原性
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3株脑心肌炎病毒河南分离株VP1基因的序列测定与遗传进化分析
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作者 常洪涛 陈陆 +5 位作者 杜季梅 杨霞 王新卫 赵军 姚惠霞 王川庆 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第3期24-28,共5页
为研究野猪家养在猪场脑心肌炎(EMC)发生发展过程中可能扮演的角色和鼠在不同猪源脑心肌炎病毒(EMCV)交叉感染中的作用,应用 RT-PCR和测序技术,对分离自河南省同一发病猪场的良种猪源、家养野猪源和鼠源EMCV 等3株病毒的VP1基因... 为研究野猪家养在猪场脑心肌炎(EMC)发生发展过程中可能扮演的角色和鼠在不同猪源脑心肌炎病毒(EMCV)交叉感染中的作用,应用 RT-PCR和测序技术,对分离自河南省同一发病猪场的良种猪源、家养野猪源和鼠源EMCV 等3株病毒的VP1基因进行序列比较和遗传进化分析,发现 EMCV可分为G1、G2和G33个群。3株分离病毒的遗传距离较近,核苷酸序列同源性高达99.6%~99.8%,并与国内猪源EMCV亲缘关系最近,同属于G1群,而与欧美毒株的亲缘关系较远,存在较大的地域差异。研究结果证实,野猪家养可传播EMCV并引起良种猪感染发病,鼠在不同猪源 EMCV的交叉感染、传播与流行中起到重要媒介作用;分离自同一猪场的良种猪源EMCV和家养野猪源 EMCV应是同一株病毒对不同猪种的感染,因而需要在野生动物家养活动中充分考虑自然疫源性疾病传播的生态学因素。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 猪源 家养野猪源和鼠源毒株 反转录-聚合酶链反应 vp1 分子进化
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猪脑心肌炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用 被引量:4
3
作者 陆文俊 施开创 +3 位作者 屈素洁 莫胜兰 李向涛 钟诚 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第12期6-10,共5页
以猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)VP1重组蛋白为包被抗原,建立了检测EMCV血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。经优化,获得间接ELISA的最佳反应条件为抗原包被浓度0.625μg/mL... 以猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)VP1重组蛋白为包被抗原,建立了检测EMCV血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。经优化,获得间接ELISA的最佳反应条件为抗原包被浓度0.625μg/mL,待检血清稀释度为1∶40,封闭液为50g/L脱脂乳,酶标兔抗猪抗体稀释度为1∶6 000,底物显色时间为室温避光15min,血清样本阴阳性临界值为OD450nm值≥0.33。与口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)、猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)抗体没有交叉反应。应用所建立的方法对广西2010年—2011年所采集的2 228份血清进行检测,被检血清样品平均阳性率为91.47%,被检猪场阳性率为100%。表明广西地区猪群感染普遍。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 vp1重组蛋白 间接ELISA 血清学调查
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小鼠IFN-γ基因的克隆及其分子佐剂作用的研究 被引量:1
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作者 刘勇 王海燕 +2 位作者 张甲 王雨舟 张冰 《实验动物与比较医学》 CAS 2008年第6期367-371,共5页
目的通过融合表达小鼠IFN-γ(MuIFN-γ)与猪脑心肌炎病毒(EMCV)结构蛋白VP1研究MuIFN-γ的分子佐剂作用。方法通过RT-PCR克隆IFN-γ的成熟肽基因,从pGEX-6p-1/vp1中亚克隆猪脑心肌炎病毒(EMCV)抗原基因VP1,分别构建原核表达菌株pET32-a/... 目的通过融合表达小鼠IFN-γ(MuIFN-γ)与猪脑心肌炎病毒(EMCV)结构蛋白VP1研究MuIFN-γ的分子佐剂作用。方法通过RT-PCR克隆IFN-γ的成熟肽基因,从pGEX-6p-1/vp1中亚克隆猪脑心肌炎病毒(EMCV)抗原基因VP1,分别构建原核表达菌株pET32-a/VP1/Rosetta(DE3)和pET32-a/VP1/MuIFN-γ,将VP1及VP1与MuIFN-γ在宿主菌Rosetta(DE3)中进行表达与共表达。将表达的VP1及MuIFN-γ/VP1蛋白分别免疫BALB/c小鼠,每次免疫2周后采血,分离血清,利用ELISA测定抗体效价。结果表达的VP1蛋白分子量为60kD,共表达蛋白MuIFN-γ/VP1分子量为73kD,VP1及MuIFN-γ/VP1蛋白免疫小鼠测定的抗体效价分别为1:32000和1:128000。结论表达的VP1蛋白具有良好的免疫原性,可刺激免疫小鼠产生明显的体液免疫反应。MuIFN-γ/VP1免疫小鼠后产生的佐剂效果要强于弗氏佐剂。MuIFN-γ/VP1蛋白能增强小鼠的体液免疫水平,MuIFN-γ具有一定的分子佐剂效应。 展开更多
关键词 MuIFN—γ emcv vp1 原核表达 免疫佐剂
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脑心肌炎病毒VP1结构蛋白的可溶性表达及鉴定 被引量:6
5
作者 李向茸 冯若飞 +4 位作者 凡静静 张海霞 韦鹏建 樊得英 马忠仁 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期557-561,共5页
为获得可溶性表达的脑心肌炎病毒(EMCV)结构蛋白VP1片段,将EMCV VP1基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌中。采用不同温度、不同IPTG浓度及不同诱导时间诱导目的蛋白表达,以筛选VP1融合蛋白可溶性表达的... 为获得可溶性表达的脑心肌炎病毒(EMCV)结构蛋白VP1片段,将EMCV VP1基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌中。采用不同温度、不同IPTG浓度及不同诱导时间诱导目的蛋白表达,以筛选VP1融合蛋白可溶性表达的最佳条件,并通过Western-blotting检测最佳条件下表达蛋白的免疫活性。PCR、酶切鉴定及测序结果表明,VP1基因已克隆入pGEX-4T-1质粒。经优化,确定VP1融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:当D600nm值为0.4~0.6时,以0.25mmol/L IPTG于25℃条件下诱导表达12h。Western-blotting结果显示,诱导表达的蛋白具有免疫活性。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 vp1基因 可溶性表达 原核表达
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脑心肌炎病毒VP1基因重组腺病毒的构建及对小鼠免疫效果的研究 被引量:1
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作者 张海霞 令瑛 +8 位作者 杨术伟 凡静静 李琼毅 李向茸 马玉梅 包晓婧 魏嘉 马忠仁 冯若飞 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期315-321,共7页
为构建脑心肌炎病毒(EM CV)VP1基因的重组腺病毒,以期为EMCV疫苗研制提供试验依据。扩增EMCV VP1基因并与载体p Yr-adshuttle-4连接构建p Yr-ads-4-VP1穿梭载体;穿梭质粒通过体外重组与腺病毒载体进行重组,获得p Ad-VP1-EG FP重组腺病... 为构建脑心肌炎病毒(EM CV)VP1基因的重组腺病毒,以期为EMCV疫苗研制提供试验依据。扩增EMCV VP1基因并与载体p Yr-adshuttle-4连接构建p Yr-ads-4-VP1穿梭载体;穿梭质粒通过体外重组与腺病毒载体进行重组,获得p Ad-VP1-EG FP重组腺病毒载体,将此载体于H EK 293细胞中包装最终成功获得r Ad-VP1-EGFP重组腺病毒,并测定其TCID50;构建的重组腺病毒感染细胞后在基因水平、蛋白水平对VP1进行检测;最后通过对小鼠免疫重组腺病毒后进行EMCV攻毒试验,验证其免疫效果。结果显示,成功构建了EMCV VP1基因重组腺病毒r Ad-VP1-EGFP,测得其TCID50为10-8.5/m L;感染细胞后基因水平及蛋白水平均可检测到VP1基因的表达;重组腺病毒免疫小鼠后的存活情况表明,重组腺病毒对小鼠有较好的免疫效果,且二次免疫后保护率显著高于单次免疫。结果表明,本试验成功制备了EMCV基因重组腺病毒,且对小鼠具有较好的免疫效果,可为进一步开发EMCV基因工程疫苗奠定基础。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 结构蛋白vp1 腺病毒 免疫效果
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靶向脑心肌炎病毒VP1基因的shRNA对脑心肌炎病毒复制的抑制作用 被引量:1
7
作者 冯若飞 李向茸 +3 位作者 张海霞 张蕾 马忠仁 王永录 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期551-557,共7页
选择脑心肌炎病毒(EMCV)VP1基因,探讨了shRNA对EMCV复制的影响。设计合成4对编码siRNA的VP1基因的DNA序列,分别构建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干扰载体X109-1、X109-2、X109-3和X109-4,脂质体介导转染至BHK21细胞,接种EMCV。病毒TCID50和实... 选择脑心肌炎病毒(EMCV)VP1基因,探讨了shRNA对EMCV复制的影响。设计合成4对编码siRNA的VP1基因的DNA序列,分别构建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR干扰载体X109-1、X109-2、X109-3和X109-4,脂质体介导转染至BHK21细胞,接种EMCV。病毒TCID50和实时荧光定量PCR结果表明,4种重组EMCV VP1shRNA对EMCV的复制均有抑制作用,其中X109-2的抑制作用最显著。X109-2转染BHK21细胞后分别接种EMCV、口蹄疫病毒(FMDV)、乙型脑炎病毒(JEV),EMCV的lgTCID50为3.5,FMDV和JEV的lgTCID50均在7.0以上,说明重组shRNA质粒对EMCV复制的抑制具有明确的特异性和干扰的靶向性。X109-2和pEGFP-VP1真核表达载体共转染CHO-K1细胞后,RT-PCR和Western-blot检测结果表明,VP1shRNA可抑制pEGFP-VP1在细胞中的蛋白表达,进一步证明了干扰载体的靶向性。上述结果为进一步研究EMCV的感染和复制机制奠定了基础。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 RNA干扰 SHRNA vp1基因
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脑心肌炎病毒GS01株VP1基因表达载体的构建及酵母表达
8
作者 李向茸 李倩 +4 位作者 马瑞仙 李生军 谢晶莹 王兴陇 冯若飞 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第6期629-633,共5页
目的构建脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)GS01株衣壳蛋白VP1的真核表达载体,并利用酵母真核表达系统获得具有抗原性的分泌性VP1成熟多肽。方法扩增EMCV GS01株VP1基因,与酵母表达载体pPIC9K重组,构建表达质粒p PIC9K-VP1... 目的构建脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)GS01株衣壳蛋白VP1的真核表达载体,并利用酵母真核表达系统获得具有抗原性的分泌性VP1成熟多肽。方法扩增EMCV GS01株VP1基因,与酵母表达载体pPIC9K重组,构建表达质粒p PIC9K-VP1;用醋酸锂转化法转化酵母菌GS115,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子;阳性克隆经甲醇诱导表达后,利用SDS-PAGE及Western blot鉴定培养上清中VP1蛋白的表达情况及抗原性。结果重组质粒pPIC9K-VP1经酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的VP1蛋白相对分子质量约34 000,为分泌性表达,能被兔抗EMCV盐析血清特异性识别,具有天然VP1蛋白的反应原性。结论实现了EMCV GS01株VP1蛋白的酵母真核表达,为在体外研究VP1与宿主细胞的相互作用机制及EMCV基因工程疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 vp1基因 酵母表达 反应原性
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嵌合口蹄疫病毒VP1抗原基因的重组脑心肌炎病毒的构建及鉴定
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作者 王露露 张武超 +4 位作者 雷白时 包银莉 王志刚 赵款 袁万哲 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期1405-1414,共10页
将口蹄疫病毒(FMDV)VP1全长、VP1 B细胞表位(135~160、198~213aa)和T细胞表位(20~40aa)组合为不同长度分别插入脑心肌炎病毒(EMCV),构建嵌合FMDV VP1重组EMCV。通过融合PCR及酶切的方法,将外源片段插入EMCV L蛋白第5、6位aa之间,得到重... 将口蹄疫病毒(FMDV)VP1全长、VP1 B细胞表位(135~160、198~213aa)和T细胞表位(20~40aa)组合为不同长度分别插入脑心肌炎病毒(EMCV),构建嵌合FMDV VP1重组EMCV。通过融合PCR及酶切的方法,将外源片段插入EMCV L蛋白第5、6位aa之间,得到重组质粒pWSK-EMCV-FMDV VP1、pWSK-EMCV-FMDV VP1(TB)和pWSK-EMCV-FMDV VP1(2TB),将其转染至BSR T7/5细胞拯救重组病毒EMCV/RvBD_(2)W-VP1、EMCV/RvBD_(2)W-VP1(TB)和EMCV/RvBD_(2)W-VP1(2TB),并在BHK-21细胞传代分析重组病毒的生物学特性。结果显示,PCR扩增得到1344 bp、909 bp和1155 bp的外源基因融合片段,表明成功构建了3种重组质粒;3株重组病毒EMCV/RvBD_(2)W-VP1、EMCV/RvBD_(2)W-VP1(TB)和EMCV/RvBD_(2)W-VP1(2TB)在BHK-21细胞传至F5代,病毒滴度分别为1×10^(7.85)TCID_(50)/mL、1×10^(8.06)TCID_(50)/mL、1×10^(7.76)TCID_(50)/mL;通过RT-PCR、IFA等方法对F5代重组病毒进行鉴定,显示重组病毒EMCV/RvBD_(2)W-VP1(TB)可以稳定遗传,且病毒复制水平与亲本病毒相一致,而其他2株重组病毒在传代过程中缺失。结果表明,本研究构建了3个重组EMCV质粒,转染细胞后携带FMDV VP1抗原表位的重组病毒稳定遗传,为后续以EMCV为骨架构建活载体疫苗奠定了理论基础。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 脑心肌炎病毒 感染性克隆 vp1
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