基于CRISPR/Cas9技术建立Lepr与eNos双基因敲除的糖尿病肾病小鼠模型

目的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术建立瘦素受体基因(leptin receptor,Lepr)与血管内皮一氧化氮合酶基因(endothelial nitric oxide synthase,eNos)双基因敲除(double-knockout,DKO)小鼠模型,构建晚期糖尿病肾病小鼠模型。方法根据eNos基因制备对应的gRNA,将CRISPR-Cas9体系显微注射于C57BL/Ks(BKS)背景小鼠的受精卵内。将受精卵转移至有假孕状态雌性小鼠的输卵管内部。幼鼠出生后经聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定及测序分析分选出为eNos^(+/-)基因型的F0代阳性小鼠,获得BKS背景下的Lepr基因杂合小鼠,即基因型为Lepr^(db/m)的Lepr-F0代杂合子小鼠。将eNos-F0与Lepr-F0代小鼠杂交,获得eNos^(+/-)/Lepr^(db/m)双杂合F1代小鼠,将双杂合F1代小鼠进一步交配,筛选得到Lepr与eNos双基因敲除小鼠。采用PCR法鉴定小鼠基因型,按基因鉴定结果分为野生型(wild-type,WT)组与DKO组小鼠。监测各组小鼠体质量、血糖与饮水进食量;采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠尿白蛋白与尿肌酐水平,并计算尿白蛋白排泄率;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)与过碘酸六胺银(periodic acid-silver metheramine,PASM)染色检查各组小鼠肾组织病理改变。结果PCR检测结果显示,成功构建lepr^(db/db)/eNos^(-/-)DKO小鼠。与同窝对照组相比,DKO小鼠的体质量、血糖水平与饮水进食量均显著高于同窝对照小鼠。DKO小鼠的尿白蛋白与尿白蛋白排泄率显著高于WT小鼠。病理学结果显示,DKO小鼠的肾小球体积明显增大,系膜基质增生明显。结论基于CRISPR/Cas9基因编辑技术可成功构建lepr^(db/db)/eNos^(-/-)DKO小鼠,DKO小鼠可反映糖尿病肾病的典型表现,为深入研究糖尿病肾病的作用机制提供动物模型。

健胃消胀片通过调节PI3K-Akt-eNOS通路改善大鼠胃癌前病变

【目的】探讨健胃消胀片对大鼠胃癌前病变的治疗作用及机制。【方法】将40只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、叶酸组和健胃消胀片组,每组10只。除正常组,其他3组大鼠采用雷尼替丁水溶液灌胃联合N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)溶液饮用法制备胃癌前病变模型。成功造模后,相应给药治疗7周。记录造模及给药期间大鼠体质量变化,观察胃部大体观并进行病理评分,测定脾脏、肝脏系数,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察胃组织病理形态变化,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测血清胃泌素(GAS)、胃动素(MTL)、胰高血糖素(GC)含量,阿利新蓝-过碘酸雪夫氏(AB-PAS)染色法观察胃组织黏膜层厚度,蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测胃组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白的表达,免疫荧光染色法检测胃组织血管内皮细胞生长因子A(VEGFA)蛋白的表达。【结果】与正常组比较,模型组大鼠实验期间体质量增长慢,胃部大体观病理评分显著升高(P<0.01),脾脏系数和肝脏系数显著降低(P<0.01),胃组织出现杯状细胞增生、肠化生现象,胃组织炎症评分显著升高(P<0.01),血清GAS含量显著升高(P<0.01),MTL、GC含量显著降低(P<0.05),胃组织黏膜层厚度显著减小(P<0.05),PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、eNOS蛋白表达水平降低(P<0.01),VEGFA蛋白表达水平降低(P<0.01);与模型组比较,健胃消胀片组和叶酸组上述指标均得到明显改善(P<0.05或P<0.01),其中,在胃组织杯状细胞增生、肠化生现象,血清GAS含量,胃组织黏膜层厚度方面,健胃消胀片组改善效果更优。【结论】健胃消胀片可改善大鼠胃癌前病变,其机制可能与激活PI3K-Akt-eNOS通路进而促进胃损伤组织的血管生成和修复能力有关。

猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗对仔猪免疫效果的研究

为了评价猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗(Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗)对仔猪的免疫效果,试验将12头仔猪随机分为3组,分别为Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组、重组空载体腺病毒组和PBS对照组,分别于3组仔猪的颈部肌肉注射Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗(浓度为1×10^(10)pfu/mL)、空载体重组腺病毒(浓度为1×10^(10)pfu/mL)和PBS各2.5 mL,于试验第0,21天分两次免疫。第2次免疫后第14天,麻醉后手术切除仔猪脾脏,采用密度梯度离心法提取猪脾脏淋巴细胞,利用流式细胞仪检测仔猪CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞含量。于第1次免疫前(第0天)及免疫后第7,14,21,28,35,42,49天无菌采集各组试验猪的颈静脉血,分离血清,检测每组仔猪抗猪附红细胞体特异性抗体IgG效价及IgG_(1)、IgG_(2a)和细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)水平,评价Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗对仔猪的细胞与体液免疫应答效果。结果表明:Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组的CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞含量极显著高于重组空载体腺病毒组和PBS对照组(P<0.01),Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组的CD4^(+)/CD8^(+)显著高于重组空载体腺病毒组和PBS对照组(P<0.05),重组空载体腺病毒组和PBS对照组之间的CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞含量及CD4^(+)/CD8^(+)差异不显著(P>0.05)。免疫后第28,35,42,49天,Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组的抗猪附红细胞体特异性IgG抗体效价及IgG_(1)、IgG_(2a)和细胞因子IL-4和IFN-γ水平极显著高于重组空载体腺病毒组与PBS对照组(P<0.01),重组空载体腺病毒组与PBS对照组之间差异不显著(P>0.05)。说明猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗可以诱导仔猪产生强烈的细胞免疫和体液免疫应答。

替格瑞洛通过akt/AMPK/eNOS信号通路调节AMI后小鼠血管新生及其机制研究

目的 探究替格瑞洛通过akt/AMPK/eNOS通路调节腺苷浓度,进而促进急性心肌梗死(AMI)后血管新生的作用,并探讨其潜在机制。方法 采用冠脉结扎法建立AMI的小鼠模型,使用替格瑞洛灌胃处理建立实验组,通过akt抑制剂Perifosine、AMPK抑制剂Dorsomorphin和腺苷受体抑制剂MRS1523建立对应蛋白抑制的模型,采用HE染色、Masson染色评估心肌损害情况,采用免疫组化、rt-PCR、Western blot检测VEGF蛋白水平和mRNA水平表达情况,采用酶标法检测AMI小鼠体内腺苷表达情况,随后采用Western blot检测akt/AMPK/eNOS通路蛋白及其磷酸化形式的表达情况。结果 替格瑞洛可明显上调p-akt/akt和p-eNOS/eNOS比值,下降p-AMPK/AMPK比值,并增加AMI后小鼠体内腺苷水平,进而促进心肌梗死后局部心肌细胞内VEGF蛋白水平和mRNA水平表达。结论 替格瑞洛可通过活化akt/AMPK/eNOS系统来调节AMI后小鼠体内腺苷浓度,进而促进局部心肌细胞内VEGF蛋白水平和mRNA水平表达。

小麦烯醇化酶基因ENO2的可变翻译分析和原核表达

【目的】鉴定重要农作物小麦(Triticum aestivum L.)上参与糖酵解的烯醇化酶家族成员ENO2编码基因TaENO2,分析TaENO2的可变翻译特征及产物蛋白的烯醇化酶活性。【方法】采用生物信息学方法鉴定小麦基因组中的TaENO2基因;选择1个TaENO2为代表,以原生质体为受体通过外源表达方法分析该基因的可变翻译产物,通过原核表达和亲和层析过程纯化该基因的重组蛋白产物并测定其烯醇化酶活性。【结果】小麦的六倍体基因组中含有3个部分同源的TaENO2基因,3个基因的产物蛋白含有保守的烯醇化酶活性中心,编码烯醇化酶蛋白序列第94位甲硫氨酸残基(M94)的ATG密码子(ATG^(M94))是潜在的内部可变翻译起始位点。在原生质体中,外源导入的TaENO2表达出定位于细胞质和细胞核的全长产物烯醇化酶和定位于细胞核的N端截短产物转录抑制因子TaMBP-1两种蛋白,而外源导入的突变ATG^(M94)后的TaENO2基因只表达全长产物烯醇化酶。获得了纯度较高的可溶性重组蛋白GST-TaENO2,该重组蛋白在体外能够催化由2-磷酸-甘油酸(2-PGA)向磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转变的烯醇化酶反应。【结论】小麦基因组含有3个烯醇化酶ENO2编码基因TaENO2。在外源表达的情况下,TaENO2表现可变翻译特征,可分别从第一起始密码子和内部ATG^(M94)密码子处起始表达出全长形式的烯醇化酶蛋白和N端截短形式的TaMBP-1蛋白。原核表达的重组蛋白GST-TaENO2具有体外烯醇化酶活性。

人胚胎干细胞衍生的神经干细胞微囊泡通过调节AKT/eNOS信号通路促进坐骨神经损伤大鼠坐骨神经再生和修复

目的探讨人胚胎干细胞衍生的神经干细胞微囊泡(hESC-NSC-MVs)通过调节蛋白激酶B(AKT)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路促进坐骨神经损伤(SNI)大鼠坐骨神经再生和修复的作用。方法取SD大鼠随机分为假手术组、模型组、hESC-NSC组、hESC-NSC-MVs组、hESC-NSC-MVs+CCT128930(AKT抑制剂)组,每组10只,模型组和实验干预组大鼠建立SNI模型,以hESC-NSC、hESC-NSC-MVs和CCT128930分组干预后,以坐骨神经功能指数(SFI)评测各组大鼠坐骨神经功能;检测各组大鼠坐骨神经传导速度、支配的腓肠肌恢复情况(以腓肠肌湿重比、肌纤维横截面积评测);透射电子显微镜(TEM)检测各组大鼠坐骨神经超微结构;试剂盒测定各组大鼠血清与坐骨神经eNOS和一氧化氮(NO)水平;免疫印迹实验检测各组大鼠坐骨神经AKT/eNOS信号通路相关蛋白表达。结果假手术组相比,模型组大鼠坐骨神经超微结构发生显著损伤,SFI、坐骨神经传导速度、腓肠肌湿重比、肌纤维横截面积、eNOS和NO水平、p-AKT/AKT与eNOS蛋白表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,hESC-NSC组、hESC-NSC-MVs组大鼠坐骨神经超微结构损伤均减轻,SFI、坐骨神经传导速度、腓肠肌湿重比、肌纤维横截面积、eNOS和NO水平、p-AKT/AKT与eNOS蛋白表达均升高,且hESC-NSC-MVs对SNI大鼠上述各指标的作用更强(P<0.05);与hESC-NSC-MVs组相比,hESC-NSC-MVs+CCT128930组大鼠坐骨神经超微结构损伤加重,SFI、坐骨神经传导速度、腓肠肌湿重比、肌纤维横截面积、eNOS和NO水平、p-AKT/AKT与eNOS蛋白表达降低(P<0.05)。结论hESC-NSC-MVs可通过激活AKT/eNOS信号通路而减轻SNI大鼠坐骨神经超微结构及功能损伤,促使坐骨神经再生和修复,并改善其坐骨神经功能。

慢性氟中毒环境对大鼠正畸牙移动过程中牙周组织VEGF和eNOS表达的影响

目的:通过观察慢性氟中毒大鼠牙移动过程中牙周组织内血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的表达变化,初步探究机体慢性氟中毒状态对大鼠正畸牙移动过程中牙周组织血管生成的影响。方法:选取3周龄SPF级SD大鼠120只,体重(60±5)g,随机分为空白组(C)、染氟组(F)、正畸组(O)、染氟正畸组(FO),每组雌雄各15只,根据正畸加力时间分为0、3、7、14、28 d组,共5个时间亚组。分别相应时间点处死各组大鼠,苏木精-伊红染色观察牙周组织血管情况,免疫组织化学染色观察大鼠牙周组织VEGF及eNOS蛋白表达情况。结果:(1)慢性氟中毒大鼠及正畸牙移动大鼠模型复制成功;(2)O组牙周纤维排列较C组紊乱,牙周血管数量增多,管腔不规则。FO组血管新生分布不及O组突出。(3)各组雌雄大鼠间VEGF、eNOS表达无明显性别差异,O组、FO组张力侧VEGF、eNOS表达与压力侧相比无明显统计学差异。(4)FO组VEGF、eNOS的蛋白平均表达水平高于F组,但低于O组,且差异有统计学意义。(5)O组、FO组VEGF、eNOS蛋白表达随时间延长呈先升高后降低趋势,第3天表现为峰值。结论:慢性氟中毒会抑制大鼠牙移动过程中牙周组织VEGF、eNOS的表达。

淫羊藿苷基于PLCγ1/AKT/eNOS/NO信号通路改善大鼠少弱精症

目的:探究淫羊藿苷对少弱精症的治疗作用及其作用机制。方法:以奥硝唑(800 mg/kg)所致少弱精症大鼠为动物模型,以淫羊藿苷(50、100 mg/kg)及左卡尼汀(100 mg/kg)干预。称量生殖器官质量,统计实验产仔率,分析附睾精子密度和精子活力;ELISA试剂盒检测血清睾酮含量;苏木精-伊红(HE)观察各组大鼠睾丸组织病理学;免疫荧光染色检测生精小管Sertoli细胞数量;试剂盒测定血清NO含量;Western Blot检测睾丸p-PLCγ1、p-AKT、p-eNOS表达。结果:与正常对照组比较,模型组大鼠睾丸指数、附睾指数、产仔率、附睾精子密度、附睾精子活力、血清睾酮含量、睾丸组织NO含量、生精小管直径及Sertoli细胞数量和睾丸组织PLCγ1、AKT、eNOS蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较,淫羊藿苷100 mg/kg组大鼠睾丸指数、附睾指数、产仔率、附睾精子密度、附睾精子活力、血清睾酮含量、睾丸组织NO含量、生精小管直径及Sertoli细胞数量和睾丸组织PLCγ1、AKT、eNOS蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.01)。结论:淫羊藿苷可以改善少弱精症,其机制可能与PLCγ1/AKT/eNOS/NO通路有关。

AENO:a Novel Reconstruction Method in Conjunction with ADER Schemes for Hyperbolic Equations

In this paper,we present a novel spatial reconstruction scheme,called AENO,that results from a special averaging of the ENO polynomial and its closest neighbour,while retaining the stencil direction decided by the ENO choice.A variant of the scheme,called m-AENO,results from averaging the modified ENO(m-ENO)polynomial and its closest neighbour.The concept is thoroughly assessed for the one-dimensional linear advection equation and for a one-dimensional non-linear hyperbolic system,in conjunction with the fully discrete,high-order ADER approach implemented up to fifth order of accuracy in both space and time.The results,as compared to the conventional ENO,m-ENO and WENO schemes,are very encouraging.Surprisingly,our results show that the L_(1)-errors of the novel AENO approach are the smallest for most cases considered.Crucially,for a chosen error size,AENO turns out to be the most efficient method of all five methods tested.

近红外荧光成像监测ENO1 mAb在宫颈癌荷瘤小鼠体内生物分布的研究

本研究探讨近红外荧光成像(NIRF)观察烯醇化酶1(ENO1)单克隆抗体(mAb)在宫颈癌荷瘤小鼠体内的分布、代谢及肿瘤靶向效率。利用癌症基因组图谱分析ENO1的表达与肿瘤分期和预后以及肿瘤免疫浸润的关系;Cy7-NHS和FITC与ENO1 mAb偶联成Cy7-ENO1 mAb和FITC-ENO1 mAb,通过激光共聚焦显微镜验证ENO1 mAb在宫颈癌细胞TC-1的定位,并建立宫颈癌皮下肿瘤模型,尾静脉注射Cy7-ENO1 mAb后在1、6、24、48、72和120 h进行近红外荧光成像,成像24 h后迅速解剖主要脏器进行体外成像。生物信息学分析结果表明ENO1在正常宫颈组织与宫颈癌组织中的表达有显著差异,免疫组织化学(IHC)结果提示ENO1蛋白在宫颈癌组织中高表达;此外,其表达与肿瘤分期和淋巴结分期显著相关,并且ENO1的高表达与多种糖酵解酶相关;激光共聚焦显微镜扫描显示FITC-ENO1 mAb能特异性结合在TC-1细胞膜表面,细胞未见内化;近红外荧光成像证明Cy7-ENO1 mAb主要富集在肝脏、肾脏和肿瘤组织,并且具有较高的肿瘤靶向效率。NIRF成像可以实时、动态监测ENO1 mAb在宫颈癌荷瘤小鼠体内的分布,其代谢器官主要是肝脏和肾脏,并且证实ENO1 mAb具有靶向宫颈癌作用。

基于VEGF/PI3K/Akt/eNOS信号通路探讨木犀草素干预A型流感病毒的作用机制

目的探讨木犀草素对A型流感病毒(influenza A virus,IAV)感染的小鼠肺上皮细胞损伤模型的作用机制。方法将小鼠肺上皮MLE-12细胞分为正常组、模型组、奥司他韦组、高剂量组和低剂量组,除正常组外,其余4组均使用IAV感染,正常组加入等量病毒稀释液;2 h后弃病毒工作液,正常组和模型组加入病毒维持液,药物组加入用病毒维持液稀释的药物工作液,干预8 h后收集细胞。使用CCK-8检测细胞增殖情况;ELISA实验检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达;免疫荧光检测细胞内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达情况;RT-qPCR技术检测细胞内VEGF、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)mRNA表达情况;Western blot法检测细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS蛋白表达情况。结果CCK-8结果显示,不同浓度的木犀草素均能降低IAV感染所致的细胞损伤(P<0.01),其EC50值为7.204μmol/L,因此,将后续实验中的木犀草素药物浓度定为5μmol/L和2.5μmol/L。与正常组相比,模型组细胞上清液中TNF-α和IL-6升高(P<0.01),细胞内VEGF的荧光蛋白强度增强(P<0.01),细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS的mRNA和蛋白的表达升高(P<0.01);与模型组相比,高剂量组和低剂量组细胞上清液中TNF-α和IL-6降低(P<0.01),细胞内VEGF的荧光蛋白强度减弱(P<0.01),细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS的mRNA和蛋白的表达降低(P<0.01)。结论木犀草素能抑制炎性细胞因子的分泌,缓解IAV感染所致的细胞损伤,其过程可能与VEGF/PI3K/Akt/eNOS信号通路密切相关。

“调神畅志”法针刺对帕金森伴便秘模型大鼠结肠组织PI3K/AKT/eNOS信号通路的影响

目的:探讨“调神畅志”针法对帕金森(PD)伴便秘大鼠结肠组织磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/AKT/eNOS)信号通路关键标志物(PI3K、AKT、p-Akt及eNOS)的影响,并探究此针法治疗的机制。方法:采用颈背部皮下注射鱼藤酮的方法制造PD伴便秘大鼠模型,并用APO诱导检测。40只造模成功大鼠随机分为模型组、西药组、常规针刺组与调神畅志组,每组10只,另空白组、假手术组各10只,共计60只,予相应干预4周。采用Western blot法检测各组大鼠远端结肠组织中PI3K、AKT、p-Akt蛋白表达和eNOS含量。结果:与空白组相比,模型组大鼠远端结肠组织中PI3K、AKT及p-Akt蛋白表达显著降低,eNOS含量显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,西药组、常规针刺组和调神畅志组远端结肠组织PI3K、AKT及p-Akt蛋白表达均明显升高,eNOS含量均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与常规针刺组比较,调神畅志组PI3K、AKT及p-Akt蛋白表达明显较高,eNOS含量显著较低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:针刺能够改善PD伴便秘大鼠模型便秘症状,且调神畅志针刺优于常规针刺,PI3K/AKT/eNOS信号通路的激活是调神畅志针法的治疗机制之一,其作用机制是通过上调大鼠远端结肠组织中PI3K/AKT/eNOS信号通路中PI3K、AKT、p-Akt的蛋白表达和降低eNOS含量来实现的。

瓜蒌皮水提物通过PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制缺血缺氧大鼠原代心肌细胞的凋亡

以激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路、抑制心肌细胞凋亡为切入点,探究瓜蒌皮水提物(TP-W)保护心肌缺血的机制.分离大鼠心肌细胞,通过缺氧气体+无血清培养液培养制造缺血缺氧损伤模型,以模拟急性心肌缺血时的体内心肌细胞环境;同时添加PI3K特异性抑制剂(LY294002)和TP-W处理细胞,利用倒置相差显微镜观察细胞形态,噻唑兰法、末端标记法分别检测细胞存活率及凋亡率,免疫荧光联合免疫印迹方法定位、定量地检测细胞内PI3K、Akt及eNOS蛋白表达及磷酸化水平.结果显示:对上述缺血缺氧损伤的心肌细胞,TP-W可显著改善其生长状态、提高存活率、降低凋亡率;同时显著上调上述3种蛋白表达水平及磷酸化水平,但磷酸化水平均可被LY294002处理显著削弱.可见,激活PI3K/Akt/eNOS信号通路、抑制心肌细胞凋亡可能是TP-W抗心肌缺血的重要机制,也是中药“开胸除痹”的关键生物学内涵.

BET溴域抑制通过阻断VEGFR2介导的PAK1和eNOS激活抑制糖尿病大鼠视网膜病变机制

目的探究BET溴域抑制通过阻断血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)介导的p21激活激酶1(PAK1)和内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)激活抑制糖尿病大鼠视网膜病变机制。方法选择36只雄性SD大鼠,随机选取10只大鼠作为对照组,余下大鼠采用单次注射链脲霉素60 mg/kg建立糖尿病模型。将建模成功的20只大鼠随机分为模型组和BET抑制组,每组10只。对照组大鼠不建模。BET抑制组大鼠建模后,腹腔注射80 mg·kg^(-1)·d^(-1)剂量的JQ1。使用ZEISS数码显微镜和免疫组织化学分析大鼠视网膜心血管生成。通过蛋白质印迹法分析视网膜屏障功能相关蛋白的表达。通过FITC-葡聚糖泄漏实验检测大鼠内外视网膜屏障完整性。通过RT-qPCR分析大鼠视网膜炎症因子的表达。通过酶联免疫吸附试验试剂盒检测大鼠房水VEGF浓度。通过蛋白质印迹法分析视网膜VEGFR2/PAK1/eNOS的蛋白表达。结果与对照组相比,模型组和BET抑制组视网膜新血管生成量、CD34表达、albumin蛋白表达、内外视网膜FITC-葡聚糖泄漏量、IL-1β、iNOS和ICAM-1 mRNA表达、VEGF浓度、视网膜P-PAK1、P-VEGFR2和eNOS蛋白表达均升高,ZO-1和occludin蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,BET抑制组视网膜新血管生成量、CD34表达、albumin表达、内外视网膜FITC-葡聚糖泄漏量、IL-1β、iNOS和ICAM-1mRNA表达、VEGF浓度、P-PAK1、P-VEGFR2和eNOS蛋白表达均降低,ZO-1和occludin蛋白表达均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论BET溴化域通过调节VEGFR2介导的PAK1和eNOS信号通路激活抑制血管生成,降低血管通透性,改善糖尿病大鼠视网膜病变。抑制BET溴化域的策略可能为限制血管生成相关疾病提供一种新的治疗方法。

瓜蒌薤白半夏汤通过调整氧化应激激活PI3K/Akt/eNOS通路发挥对Ⅱ型糖尿病合并急性心肌缺血的保护作用

以调整氧化应激状态、激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路为切入点,探讨瓜蒌薤白半夏汤(GXBD)保护Ⅱ型糖尿病合并急性心肌缺血(T2DM-AMI)的作用机制.将36只大鼠随机分为对照组(Ctrl组)、模型组(T2DM-AMI组)、处理组(GXBD组),每组12只.对T2DM-AMI组、GXBD组联合使用灌服高脂乳剂、腹腔注射链脲佐菌素、冠脉结扎3种方法制造T2DM-AMI大鼠模型.四唑红染色检测心肌梗死率,苏木精-伊红染色检测其病理损伤情况;酶联免疫吸附法检测血浆氧化损伤成分氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、晚期糖基化终产物(AGEs)、黄嘌呤氧化酶(XO)、髓过氧化物酶(MPO),血浆抗氧化成分一氧化氮(NO)、硫氧还蛋白(Trx)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的水平或活性,以及总活性氧(T-ROS)的水平和总抗氧化能力(T-AOC);蛋白免疫印迹法检测心肌组织中PI3K、Akt和eNOS蛋白的表达及磷酸化水平,实时荧光定量PCR检测其中Pi3k、Akt和eNos基因的mRNA表达水平.结果显示T2DM-AMI大鼠心肌梗死严重,血浆中上述4种氧化损伤成分的水平或活性及T-ROS水平显著升高,3种抗氧化成分的水平或活性及T-AOC显著降低,心肌组织中PI3K、Akt和eNOS蛋白的表达及磷酸化水平显著下调,相应基因的mRNA表达水平同样显著下降,而GXBD干预可显著逆转这些病理性变化.综上,GXBD可能通过提高抗氧化能力、清除自由基、纠正异常的氧化应激状态、激活心肌组织中PI3K/Akt/eNOS信号通路,发挥对T2DM-AMI的保护作用.

益景汤经PI3K/AKT/eNOS信号通路拮抗高糖诱导的视网膜血管内皮细胞损伤

目的探讨益景汤对高糖诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞损伤的拮抗作用及机制。方法将大鼠视网膜微血管内皮细胞随机分为5组:对照组(CG)、高糖组(HG)、低浓度益景汤组(LYG)、中浓度益景汤组(MYG)、高浓度益景汤组(HYG)。细胞生长至80%~90%时,往高糖组及益景汤组培养基中加入33 mmol/L葡萄糖培养3 d造高糖内皮细胞损伤模型,第4天按分组加入相应正常糖培养基及各浓度益景汤培养24 h。使用CCK-8试剂盒检测内皮细胞活性,Transwell法观察内皮细胞迁移,荧光聚合酶链式反应(PCR)检测细胞间紧密连接蛋白ZO-1及内皮细胞磷脂酰肌醇三羟基激酶(PI3K)、苏氨酸蛋白激酶(AKT)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的信使RNA(mRNA)表达。结果高糖条件下,大鼠视网膜微血管内皮细胞活性降低,与对照组比较,差异有统计学意义(均P<0.05);与高糖组比较,低、中、高浓度益景汤组细胞活性均高于高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖条件下,大鼠视网膜微血管内皮细胞迁移增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);与高糖组比较,低、中、高浓度益景汤组细胞迁移均低于高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。高糖条件下,大鼠视网膜微血管内皮细胞间连接蛋白ZO-1及内皮细胞PI3K、AKT、eNOS的mRNA表达量均降低,与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);与高糖组比较,低、中、高浓度益景汤组细胞间连接蛋白ZO-1及内皮细胞PI3K、AKT、eNOS的mRNA表达量均高于高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论益景汤能经PI3K/AKT/eNOS信号通路抑制高糖诱导视网膜微血管内皮细胞迁移,提高细胞活性,减轻细胞损伤。

蛇床子素对大鼠信号通路AKT/eNOS/sGC/PKG及成骨细胞成熟分化的影响

目的研究蛇床子素(osthol)是否通过激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)/内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)/可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase,sGC)/蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)信号通路促进大鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROBs)矿化成熟。方法检测蛇床子素处理ROBs后,成骨性转录因子RUNX2、OSX以及AKT/eNOS/sGC/PKG信号途径蛋白表达水平、免疫荧光法观察信号通路下游蛋白核易位;检测碱性磷酸酶(alkline phosphatase,ALP)活性;用AKT特异性抑制剂MK-2206阻断AKT功能后,检测MK-2206对AKT/eNOS/sGC/PKG信号途径活性及对ROBs矿化成熟的影响,进一步评估蛇床子素促进成骨细胞矿化成熟的潜在机制。结果蛇床子素处理ROBs后,成骨性转录因子RUNX2、OSX蛋白及AKT/eNOS/sGC/PKG信号通路蛋白表达量均增加,ALP活性上升;加入AKT抑制剂后,蛇床子素不再激活AKT/eNOS/sGC/PKG信号通路,阻断了蛇床子素促进ROBs的矿化成熟。结论蛇床子素可通过激活AKT/eNOS/sGC/PKG信号通路促进成骨细胞矿化成熟。

青蒿素调控ENO2介导的肾透明细胞癌细胞有氧糖酵解的机制

目的探讨青蒿素(Artemisinin)调控ENO2对肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinomas,ccRCC细胞增殖和有氧糖酵解的作用及具体调控机制。方法分别将ccRCC细胞系OSRC2和ACHN暴露于0、10、20、30、40μmol/L青蒿素中,OSRC2和ACHN细胞经25μmol/L青蒿素处理或同时转染si-ENO2,CCK-8检测细胞活力,葡萄糖测试盒和乳酸测试盒检测葡萄糖消耗和乳酸生成量,Western blot检测HK2、LDHA和ENO2的表达,RT-qPCR检测ENO2 mRNA相对表达。结果OSRC2和ACHN细胞存活率随青蒿素浓度和暴露时间的增加而降低,OSRC2细胞的IC_(50)值为25.47μmol/L,ACHN细胞的IC_(50)值为26.31μmol/L。ENO2在OSRC2和ACHN细胞中表达升高(P<0.01),青蒿素可下调ENO2在癌细胞中的表达(P<0.05)。暴露于25μmol/L青蒿素或敲降ENO2可抑制OSRC2和ACHN细胞的存活(P<0.001)、葡萄糖消耗(P<0.05)、乳酸生成(均P<0.05)以及HK2和LDHA的蛋白表达(P<0.05)。同时敲降ENO2且暴露于25μmol/L青蒿素组中OSRC2和ACHN细胞的存活率(P<0.001)、葡萄糖消耗(P<0.05)、乳酸生成(P<0.05)以及HK2和LDHA的表达(均P<0.05)低于仅敲降ENO2组。结论青蒿素可抑制ccRCC细胞的存活率和有氧糖酵解,并通过下调ENO2在ccRCC中的表达而发挥作用。

miR-375-3p过表达调控Akt-eNOS信号通路促进心肌梗死大鼠心肌修复作用机制

目的探究miR-375-3p过表达调控丝氨酸-苏氨酸激酶(Akt)-内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路促进心肌梗死(MI)大鼠心肌修复作用的机制。方法将大鼠分为假手术(sham)组、MI组、阴性对照(NC)组、miR-375-3p组,各10只。比较各组miR-375-3p相对表达、心功能指标[左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、短轴缩短率(FS)、左室射血分数(LVEF)]、心肌损伤标志物[乳酸脱氢酶(LDH)、肌钙蛋白(cTnT)I、脑钠肽前体(Pro-BNP)]、心肌梗死面积、心肌组织病理学变化及Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表达。结果与sham组比较,MI组、NC组miR-375-3p表达显著降低;miR-375-3p组miR-375-3p表达显著高于sham组及MI组(P<0.05)。与sham组比较,MI组、NC组及miR-375-3p组LVEDD、LVESD及LDH、cTnTI、Pro-BNP显著升高,FS、LVEF及Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表达显著降低,MI面积显著增加(P<0.05)。与MI组比较,miR-375-3p组LVEDD、LVESD及LDH、cTnTI、Pro-BNP显著降低,MI面积显著减少,FS、LVEF及Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论miR-375-3p过表达可激活Akt-eNOS信号通路促进MI大鼠心肌修复。

ENO1对急性髓系白血病细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨Enolase 1(ENO1)调节急性髓系白血病(AML)细胞的代谢及分子机制。方法:分析GEO、TCGA等数据库中AML患者ENO1表达情况;运用Kaplan-Meier分析基因表达水平与患者生存期之间的关系;构建ENO1 shRNA慢病毒质粒体系,感染MV4-11、NB4细胞系构建分组,应用Western blot法检测ENO1在AML两种细胞系中的敲降效率;CCK-8法检测其对AML细胞生长的影响;Annexin V-PE/7-AAD法检测细胞凋亡情况;应用GO、KEGG富集方法分析ENO1在细胞中的功能及相关信号通路。结果:通过GEO、TCGA数据库分析表明ENO1在多数AML患者体内显著高表达(P<0.05,P<0.01),而在其它类型白血病患者中无此变化;ENO1在AML细胞中,在白血病干细胞,在AML小鼠模型造血干细胞中均显著高表达(P<0.001)。Kaplan-Meier分析表明ENO1高表达AML患者生存期显著低于ENO1低表达患者(P<0.05,HR>1)。敲降ENO1显著抑制AML细胞生长,诱导AML细胞凋亡(P<0.01)。富集分析发现,AML细胞中ENO1可能参与组蛋白甲基化、RNA干扰复合物的形成、糖代谢相关生物过程;其负相关共表达基因主要富集在自噬和FOXO信号通路。结论:ENO1在AML患者中尤其是AML干细胞中高表达并与生存期呈负相关。且ENO1高表达可促进AML细胞生长、抑制AML细胞凋亡,ENO1有望为AML患者的治疗和预后提供一定的参考。