增龄相关性听力损失大鼠耳蜗TMPRSS3和ENaC-α蛋白的表达

目的通过检测增龄相关性听力损失SD大鼠耳蜗中跨膜丝氨酸蛋白酶3(transmembrane protease,serine 3,TMPRSS3)、表皮钠通道α(epithelial sodium channel-a,ENaC-α)蛋白的表达,初步探讨其在增龄相关性听力损失中的作用。方法选用3、12及24月龄SD大鼠各30只,应用免疫组化、Western blot技术检测各组大鼠耳蜗中TMPRSS3、ENaC-α蛋白表达水平。结果随月龄增大,大鼠ABR阈值逐渐升高,耳蜗TMPRSS3、ENaC-α蛋白表达水平逐渐降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论增龄相关性听力损失大鼠的耳蜗TMPRSS3、ENaC-α蛋白随月龄增大而降低。ENaC-α蛋白的变化与TMPRSS3呈相关性,提示TMPRSS3可能通过调节ENaC-α蛋白而起作用。

稀土La-Ce合金对铝合金ENAC-44300晶粒细化及针孔度影响的试验分析

分析了不同含量下稀土La-Ce中间合金在铝合金ENAC-44300晶料细化、针孔变化中所起的作用。利用直读光谱仪对化学成份进行分析确认其添加比例,从宏观目视对断面晶粒度进行了对比、运用金相显微镜观察微观组织变化佐证了其变质细化的效果;对比各含量下针孔度变化情况。结果表明稀土La-Ce中间合金对细化铝合金晶粒度及降低铝水含气量能起到很好的作用。

辛伐他汀对A549细胞阿米洛利敏感型钠离子通道α亚基表达的影响

目的;通过体外给药的方式观察辛伐他汀对人类肺泡上皮细胞(A549细胞代替)膜上阿米洛利敏感型钠离子通道α亚基(ENaC-α)表达的影响。方法:细胞株培养,分为空白组、2.5μM组、5μM组、10μM组,培养24小时,western blot检测ENaC-α膜蛋白表达,RT-PCR检测ENaC-αmRNA表达。结果:结果显示:2.5μM组ENaC-α膜蛋白与空白组无明显差别(P>0.05),5μM组高于空白组(P<0.05),10μM组明显高于空白组(P<0.01);2.5μM组ENaC-αmRNA与空白组无明显差别(P>0.05),5μM组表达增加(P<0.05),10μM组显著增加(P<0.01)。结论:大剂量辛伐他汀增强A549细胞膜上ENaC-α膜蛋白及mRNA的表达。

硫化氢中毒对大鼠肺钠水主动转运功能的影响

目的:观察硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)中毒对大鼠肺钠水主动转运功能的影响,并探讨其机制。方法:SD大鼠充分暴露于亚致命浓度(300 ppm)的H2S气体3 h,分别于暴露后6、12、24 h检测大鼠肺泡液体清除率(alveolar fluid clearance,AFC)和肺干湿比,光镜下观察肺组织HE染色,透射电镜下观察Ⅱ型肺泡上皮细胞的改变,real-time PCR检测肺组织α-上皮钠通道(epithelial sodium channel,ENaC)mRNA的表达,Western blot检测肺组织α-ENaC以及ERK1/2的蛋白表达。结果:SD大鼠暴露于H2S后,与对照组比较,AFC明显下降,在暴露后6 h最低;肺含水量在暴露后6 h最高,并在12 h恢复至正常水平;光镜下,暴露后24 h大鼠肺组织出现明显损伤性改变;大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞在暴露后出现线粒体脊断裂、板层小体崩解;大鼠肺组织中α-ENaC mRNA在暴露后6 h表达增多,在12 h恢复至正常水平;α-ENaC的蛋白表达与对照组相比,则在暴露后6 h明显降低;大鼠肺组织ERK1/2磷酸化水平在暴露后6 h显著增高。结论:硫化氢中毒降低了大鼠AFC,其机制可能是下调了α-ENaC的表达,并且ERK1/2信号通路的激活可能参与了整个损伤过程。

新生大鼠高氧性肺损伤肺组织中AQP1、α-ENaC蛋白和mRNA表达及呋塞米雾化的干预作用

目的 探讨呋塞米雾化对新生大鼠高氧肺损伤的保护作用.方法 将新生SD大鼠随机分为空气组、高氧组和干预组,比较肺组织病理改变、肺组织AQP1,α-ENaC蛋白及mRNA表达情况.结果 空气组中的实验动物反应好,高氧组实验动物表现脱氧后烦躁不安,呼吸困难明显,其中1 只实验动物死亡.而干预组中的实验动物一般活动情况较高氧组明显改善.三组中高氧组肺组织形态与结构改变最为严重.在实验3、7、14 d时,高氧组肺组织AQP1蛋白及mRNA表达水平低于空气组(P<0.05),干预组肺组织AQP1蛋白及mRNA表达水平在实验3、7、14 d时均与空气组接近,明显高于高氧组,差异有统计学意义(P<0.05).在实验3、7、14 d时,高氧组肺组织α-ENaC的蛋白及mRNA表达水平较空气组明显下降(P<0.05),而干预组肺组织α-ENaC蛋白及mRNA表达水平较高氧组明显升高,其差异具有统计学意义(P<0.05).结论 雾化吸入呋塞米可能通过上调AQP1、α-ENaC的蛋白表达水平及mRNA表达水平,改善肺功能,从而对高氧性肺损伤起到一定保护作用.

全氟化碳乳剂对肺泡上皮细胞钠离子通道基因表达的影响

目的探讨新型全氟化碳乳剂（NPE）对A549细胞生长及其对TNF—α攻击的A549细胞钠离子通道（ENaC）表达的影响。方法A549细胞分为对照组、TNF-α组、NPE组和治疗组，TNF—α以100ng／ml的浓度攻击细胞，NPE以1／10细胞培养液体积的比例与细胞共同培养。正常组细胞不做任何处理，实验组细胞分别用NPE处理2,4、6h，用MTT法测各组细胞活力变化；用real—time PCR法检测细胞ENaC-α亚单位表达水平变化；ENaC—α蛋白表达水平采用Western-blot法检测。结果NPE对A549细胞的正常生长无明显影响；NPE可改善TNF-α对A549细胞生长的抑制作用，同时可以改善TNF—α对细胞ENaC各基因及ENaC-α蛋白表达的下调。结论NPE对TNF-α干预后的A549细胞具有一定保护作用，并可上调其钠离子通道基因及蛋白表达，从而减轻TNF-α对A549细胞的损伤。

柚皮素对急性肺损伤小鼠保护作用的机制研究

目的探讨柚皮素(Nar)对急性肺损伤(ALI)小鼠的影响及其作用机制。方法15只雌性BALB/c小鼠随机分成对照组(Control组)、模型组(LPS组)、柚皮素组(LPS+Nar组)。采用气管内滴入脂多糖(5mg/kg)建立急性肺损伤小鼠模型,造模成功后24 h取动脉血和双肺组织。HE染色观察肺组织病理改变,测定肺组织湿干重(W/D)比值,检测动脉血氧分压(PaO_(2))并计算氧合指数(OI),ELISA法检测肺组织TNF-α、IL-1β浓度水平,Western blot法检测肺组织p-SGK1、α-ENaC、Na^(+)-K^(+)-ATPaseα1蛋白表达水平。结果LPS组肺泡结构大量破坏、间隔增宽、大量炎症细胞浸润、肺泡腔内可见红细胞渗出,柚皮素干预能减轻脂多糖诱导的ALI小鼠肺组织病理改变。与Control组比较,LPS组W/D、TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05),OI、p-SGK1、α-ENaC、Na^(+)-K^(+)-ATPaseα1蛋白表达降低(P<0.05);与LPS组比较,LPS+Nar组W/D、TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05),OI、p-SGK1、α-ENaC、Na^(+)-K^(+)-ATPaseα1蛋白表达升高(P<0.05)。结论柚皮素通过抑制炎症介质的释放及上调α-ENaC、Na^(+)-K^(+)-ATPaseα1蛋白表达,对脂多糖诱导的ALI小鼠具有保护作用,其机制可能与激活SGK1信号通路有关。

利用CRISPR/Cas9技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除稳定细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除的细胞株,研究α-ENaC基因对细胞增殖的影响。构建敲除α-ENaC基因的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,通过转染和嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞株,Western Blot、测序确定突变的细胞株,CCK-8检测突变细胞株的增殖活力。成功构建靶向α-ENaC基因第一外显子的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,嘌呤霉素筛选后,挑选8个单细胞克隆中有两个单细胞克隆α-ENaC蛋白表达下降,一个单细胞克隆α-ENaC蛋白不再表达,测序结果显示3个单细胞克隆分别为2个单等位基因突变和1个双等位基因突变,且未发现脱靶现象。突变细胞株的增殖活力降低,其中双等位基因突变细胞株增殖活力降低更为显著。因此,利用CRISPR/Cas9结合SSA-RPG报告载体成功获得了α-ENaC基因敲除的L2细胞株,α-ENaC与细胞增殖有关。