猪瘟病毒Erns蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

为制备猪瘟病毒(CSFV)特异性诊断抗原,根据国内CSFV流行毒株的序列合成了其主要的保护性抗原Erns蛋白的基因序列,将合成的基因按设计的酶切位点与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建了重组表达质粒pPIC9K-Erns。用SalⅠ将重组表达质粒线性化后,转化GS115酵母菌。经筛选、鉴定,成功获得了表达CSFV的Erns蛋白的阳性重组酵母菌。该阳性重组酵母菌经甲醇诱导,在培养液上清中可检测到目的蛋白。Western-blot结果显示,该蛋白能特异识别CSFV抗体,且具有很好的反应原性。

山东省猪瘟Erns基因系统进化分析与表达模式的研究

采用RT-PCR方法从山东省采集的怀疑携带猪瘟病毒(CSFV)的病料组织中扩增出全长为696bp囊膜糖蛋白ErnscDNA,其编码232个氨基酸的蛋白质,命名为SDCQ。通过构建E^rns蛋白家族系统进化树分析可知,山东省内流行的CS-FV毒株与传统强毒株和疫苗用毒株在主要抗原编码基因上存在较大差异。将阳性重组表达质粒pPIC9K/E^rns电转化GS115酵母菌,经筛选、鉴定、甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,在培养液上清中检测到了目的蛋白E^rns,大约50kDa。Western Blot显示,E^rns是以同源二聚体的形式存在,且表达产物可以特异性识别CSFV抗体。

猪瘟病毒Erns和E2蛋白重组表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究将CSFV Erns和E2基因的主要抗原区进行克隆,构建pET32a-Erns和pET32aEK-E2重组质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达和纯化,以纯化的rErns、rE2重组蛋白为包被抗原,经条件优化,分别建立CSFV rErns和rE2抗体间接ELISA检测方法。SDS-PAGE结果显示,分别获得约为47 kDa和42 kDa的重组蛋白,rErns重组蛋白主要在上清液中存在,rE2重组蛋白主要以包涵体形式存在。Western blot结果显示,纯化后的重组蛋白具有良好的免疫原性。通过方阵试验进行了ELISA反应条件优化,确定了Erns蛋白最佳包被量为2.5μg/mL,rE2蛋白最佳包被量为0.625μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为0.25%PVA溶液,HRP标记的兔抗猪IgG二抗最佳稀释度为1∶2000,临界值分别为0.24和0.33。上述方法仅与CSFV阳性血清发生特异性反应,检测敏感性可达到1∶1600,批内重复性和批间重复性变异系数均小于10%。本研究建立的间接ELISA方法可初步应用于CSFV Erns和E2抗体的检测,鉴别E2亚单位疫苗免疫抗体和野毒感染抗体,有利于猪瘟净化工作的实施。

抗BVDV Erns蛋白单克隆抗体制备及生物学特性鉴定

为制备抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Erns蛋白单克隆抗体,本试验用Erns重组蛋白免疫Balb/c鼠,刺激小鼠脾脏产生特异性免疫细胞;通过化学剂诱导剂PEG-4000诱导免疫细胞和骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细胞;间接ELISA方法结合亚克隆方法筛选阳性细胞孔;鉴定为稳定分泌抗体的细胞株做扩大培养,细胞悬液计数并无菌注射KM小鼠腹腔,制备、收集腹水抗体;SDS-PAGE鉴定抗体大小、ELISA测定抗体效价、Western blot和IFA鉴定抗体特异性。本试验建立了3株稳定分泌抗体的细胞株;腹水抗体重链大小为55 kDa,轻链25 kDa,均为IgG1型,效价高于10^(4),抗体可特异性结合病毒抗原。结果证实,制备的单克隆抗体效价高、特异性好,为制备检测BVDV试剂盒奠定基础。

针对猪瘟病毒Erns基因实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立针对猪瘟病毒(CSFV)的快速诊断方法,根据猪瘟病毒石门强毒株(GenBank ID:AF092448.2)已公布的Erns基因序列设计并合成特异性引物及探针,建立针对Erns基因的TaqMan荧光定量PCR检测方法,验证其特异性、敏感性、重复性,并进行临床样品及重组病毒的检测。结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法的Ct值与标准品在1×10^(9)~1×10^(2)copies/μL范围内具有很好的线性关系,相关系数为0.99,斜率为-3.661 5,检测下限为1.0×10^(1)copies/μL,与其他能引起相似临床症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于2.925 02%,证实该方法重复性好。本方法适用于临床样品中CSFV抗原核酸的检测,同时也可以用于CSFV在细胞上增殖情况的检测和本实验室构建的表达CSFV Erns基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴定及检测,对于临床上CSFV抗原检测、CSF诊断及CSFV的实验室研究有重要意义。

牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体诱发细胞焦亡的研究

【目的】牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是引起牛病毒性腹泻-黏膜病的关键病毒。BVDV的结构蛋白Erns可在病毒感染的初期削弱宿主的免疫防御,引发牛群炎症反应。核苷酸寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体是NOD样受体(NOD-like receptor,NLRs)家族重要成员,调控炎症性疾病的发生发展,同时激活的NLRP3炎症小体能够引起宿主细胞焦亡,进而诱发级联放大的炎症反应。但BVDV Erns蛋白在BVDV感染诱发炎症反应的分子机制尚不清楚。【方法】为进一步探索Erns蛋白对BVDV感染激活NLRP3炎症小体诱发细胞焦亡的影响,构建了BVDV Erns蛋白的真核表达质粒pCMV-HA-Erns,过表达BVDV Erns蛋白,检测BVDV感染细胞中NLRP3炎症小体组分[半胱氨酸蛋白酶(caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)和NLRP3]、IL-1β的mRNA转录水平和蛋白表达水平,以及细胞死亡调节蛋白(gasdermin D,GSDMD)的基因表达和蛋白剪切情况,并通过扫描电镜观察牛睾丸(bovine testis,BT)细胞膜成孔及BT细胞内容物释放情况,以分析Erns蛋白诱导BT细胞产生细胞焦亡。【结果】Erns蛋白能够显著引起NLRP3炎症小体活化进而激活caspase-1,活化的caspase-1一方面切割GSDMD,形成有活性的GSDMD-N端并在BT细胞膜形成孔洞,释放内容物,诱导BT细胞发生细胞焦亡;另一方面活化的caspase-1切割pro-IL-1β,形成有活性的IL-1β,并释放到BT细胞外,引起BT细胞上清中IL-1β水平上升。【结论】系统解析了BVDV Erns蛋白激活NLRP3炎症小体介导细胞焦亡的产生,对疫苗及治疗药物的研制具有重要指导意义。

基于Erns和E2基因的猪瘟标记疫苗研究概述

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是猪的一种急性、热性和致死性传染病。该病流行范围很广,而且致死率极高,给世界养猪业造成严重危害。目前,猪瘟流行地区或国家仍然采用接种弱毒疫苗的方法作为预防猪瘟的主要策略,但接种弱毒疫苗的传统预防控制方法无法区别猪瘟疫苗免疫抗体和野毒感染抗体。为了净化、消灭猪瘟,新型标记疫苗的研究已迫在眉睫。近些年,陆续有国内外研究者应用分子生物学和基因工程方法,对猪瘟野毒株或弱毒株进行基因修饰构建出新毒株,其中以Erns和E2为基础构建新毒株的方法占据着重要地位。部分候选疫苗具有较好的免疫效果,可用于区分免疫和自然感染动物,而且有望作为新一代疫苗来替代传统弱毒疫苗。

动机对错误加工影响的研究综述

错误加工是个体不断优化行为表现并适应环境以实现目标行为的重要加工机制。以往的研究发现,动机会对个体的错误加工造成影响。本文总结了错误加工的机制以及动机对错误加工的影响。错误加工主要有两个ERP成分,分别是错误相关负波(ERN)和错误相关正波(Pe)。研究表明动机对错误加工的ERN和Pe都有影响。这可能是因为动机加强了错误与正确行为之间的冲突并且增加了对错误的注意力。未来的研究可以探讨在积极和消极的混合动机下的错误加工,以及对意识到和未意识到错误的影响。

炎症微环境中ERN1调节软骨细胞炎症因子的实验研究

目的:探讨内质网到细胞核信号1(endoplasmic reticulum-to-nucleus signaling 1,ERN1)基因对炎症微环境中软骨细胞炎症因子和软骨分解代谢的影响。方法:通过CRISPR-Cas9系统构建人ERN1基因敲除的C28/I2软骨细胞株(ERN1 KO);从C57BL/6J背景的ERN1软骨特异性敲除(ERN1 cKO)小鼠软骨组织分离原代软骨细胞,分别为对照组(ERN1flox/flox)、ERN1 cKO组(ERN1flox/flox-Col2Cre+);在C28/I2人正常软骨细胞中过表达ERN1腺病毒(Ad ERN1),以AdGFP为对照组;实验采用10μg/L白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导过表达ERN1软骨细胞或ERN1缺陷软骨细胞,形成炎症微环境,用qPCR和Western blot检测IL-1β处理ERN1缺失或过表达ERN1细胞后,肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)、IL-4、IL-6、IL-10等炎症因子和软骨分解代谢标志物基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP13)、含血小板结合蛋白基序的解整联蛋白及金属蛋白酶5(a disintegrin and me?talloproteinase with thrombospondin motifs 5,ADAMTS5)的表达。前交叉韧带切除(anterior cruciate ligament resec?tion,ACLT)术制作ERN1 cKO小鼠骨关节炎(osteoarthriti,OA)模型,免疫组化法检测软骨组织TNFα和IL-1β的表达。结果:成功将ERN1单向导RNA(sgRNA)构建至LentiCRISPRv2载体,并在C28/I2细胞中成功筛选出ERN1敲除稳定细胞株。qPCR结果显示,在体外炎症微环境中,敲除ERN1可上调软骨细胞促炎细胞因子IL-6和TNFαmRNA水平(P<0.05),下调抗炎细胞因子IL-4和IL-10 mRNA水平(P<0.05)。Western blot结果显示,当软骨细胞处于炎症微环境中,敲除ERN1可显著上调TNFα表达(P<0.05),增强ADAMTS5和MMP13的表达(P<0.05),而过表达ERN1则显著抑制TNFα表达(P<0.05)。免疫组化法结果显示,ACLT术后ERN1 cKO可促进TNFα、IL-1β表达。结论:ERN1基因通过调节促炎及抗炎因子平衡参与炎症反应。

猪瘟病毒C株E^(rns)/E2嵌合基因表达蛋白单克隆抗体的制备及其生物学特性的鉴定

目的:制备抗猪瘟病毒(CSFV)C株Erns/E2嵌合基因表达蛋白的单克隆抗体(mAb),探讨Erns/E2蛋白的分子结构和生物学功能。方法:在大肠杆菌RosettaTM2(DE3)中表达了猪瘟病毒(CSFV)C株Erns、E2蛋白主要抗原域的嵌合基因CSFVErns/E2蛋白;以纯化复性后的CSFVErns/E2为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗CSFVErns/E2 mAb;利用间接ELISA、Western blot、Dotblot方法鉴定mAb生物学特性。结果:获得了1株稳定分泌抗CSFVErns/E2融合蛋白的单克隆杂交瘤细胞系C8株,该株mAb的细胞培养上清效价为1∶6400,小鼠腹水效价1∶2×105。其免疫球蛋白亚类为IgG1。间接ELISA和Western blot结果显示该株mAb不与猪瘟C株细胞毒、pET-32a标签蛋白反应,仅与融合表达的CSFVErns/E2蛋白存在特异性反应。Dot blot结果表明其识别的抗原表位为E2蛋白的RSGL-CPFDTSPV氨基酸序列。结论:获得了一株能特异识别E2蛋白抗原表位的mAb,为进一步研究CSFV的分子结构及功能奠定了物质基础。

具有荧光标签的猪瘟病毒E^(rns)蛋白在杆状病毒表达系统中的表达

为了获得具有标记的猪瘟病毒Erns蛋白,通过基因工程操作,使猪瘟病毒Erns基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合,用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中高效表达了ErnsGFP融合蛋白,经Western Blot和荧光显微镜观察证实,表达产物分子量正确,且发出易于检测的绿色荧光,具有标记的Erns蛋白的获得为进一步研究Erns蛋白结构和功能奠定了基础。

猪瘟病毒E^(rns)基因的克隆与序列分析

为了解山东地区猪瘟病毒的变异情况,将6份经RT-PCR方法鉴定为猪瘟病毒(CSFV)阳性的山东地区患病猪的病料接种PK-15细胞,分离得到6株猪瘟病毒。对该6株猪瘟病毒的Erns基因主要抗原编码区序列进行了RT-PCR扩增、克隆、测序,并经DNA Star软件对测序结果与HCLV疫苗株、Shimen株及Alfort株Erns基因进行比较和分析,构建了CSFV遗传进化树。结果扩增的6株山东CSFV分离株Erns基因同源性为98.5%~100%,与HCLV疫苗株,Shimen株及Aflort株的同源性为82.9%~85.2%;6株CSFV分离株Erns蛋白的同源性为99.1%~100%,与HCLV疫苗株,Shimen株及Aflort株Erns蛋白的同源性分别为88.0%~88.4%和89.4%~89.8%。表明所分离的6株山东CSFV流行毒株的Erns基因发生了较大变异。

猪瘟病毒E^(rns)在杆状病毒系统中的表达和纯化

采用Bac-to-Bac表达系统构建重组杆状病毒rAcV-MBP-Erns,感染Sf9昆虫细胞,经免疫荧光及Western blot分析证实MBP-Erns融合蛋白在Sf9细胞中高效表达。表达的MBP-Erns以可溶和包涵体两种形式存在。在Sf9细胞中规模化增殖重组病毒,经Amylose Resin亲和层析纯化获得高纯度MBP-Erns,制备的MBP-Erns具有良好免疫原性,这些工作为研究该蛋白的生物学功能和免疫原性奠定基础。

刻板印象的ERP研究

从研究方法的角度总结了刻板印象的研究发展过程,并重点介绍了刻板印象的ERP研究取得的一些成果。刻板印象的ERP研究主要集中在种族刻板印象和性别刻板印象两个方面:种族刻板印象能引起N100、P200、N200、ERNs(关联负波)等成分波幅的变化;而视觉或听觉呈现包含男性刻板印象词或女性刻板印象词的句子时,与性别刻板印象不一致的句子激起一种后期正波P600。

猪瘟兔化弱毒株E^(rns)基因在大肠埃希氏菌中的表达、纯化

将猪瘟兔化弱毒株Erns基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经PCR和双酶切鉴定以及序列分析,表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达,经SDS-PAGE和Western-Blot检测,结果表明,融合表达蛋白的分子量约为55kD,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45%。表达蛋白与兔抗CSFV多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。利用GST亲和层析柱对Erns融合蛋白进行了纯化。

基于重组E^(rns)蛋白的牛病毒性腹泻病毒间接ELISA检测方法的建立

为建立中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体间接ELISA方法,本研究对新疆地区多个发病牛场临床发病牛肛拭子提取总RNA,RT-PCR扩增BVDV-E^(rns)基因截短片段(681 bp),将该片段克隆于表达载体中,经大肠杆菌表达并纯化后作为ELISA包被抗原,建立了间接ELISA检测方法。特异性试验显示该方法与牛其它常见5种病原阳性血清均无交叉反应。敏感性试验显示在阳性血清1∶1 600倍稀释时仍能够检出。重复性试验显示批内、批间变异系数均小于10%。与爱德士(IDEXX)商品化试剂盒相比较,总符合率较高。应用该方法对新疆地区2个散户牛场和3个规模化牛场的564份牛血清样品进行了检测,结果显示BVDV抗体阳性率分别为11.76%、13.04%、82.76%、77.96%、75.82%,表明BVDV感染在新疆部分地区已呈高发态势。该方法的建立对新疆地区BVDV的血清流行病学调查和养牛业的健康发展具有重要意义。

牛病毒性腹泻病毒E_(60~145aa)^(rns)片段可溶表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体间接ELISA检测方法,本研究对山东地区规模化奶牛场BVDV主要流行亚型的E^(rns)蛋白进行表位分析,原核可溶表达优势抗原表位片段E_(60~145aa)^(rns),经Western blot及LC-MS/MS鉴定后作为ELISA包被抗原,对影响ELISA试验的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性、重复性试验等。结果显示,间接ELISA方法优化后的条件为:0.25μg/mL抗原包被37℃2 h后4℃过夜,10%马血清封闭时间1.5 h,1∶5稀释一抗孵育1.5 h,1∶8000稀释二抗孵育60 min,显色25 min。该方法特异性、灵敏性及重复性良好,与商品化BVDV抗体检测试剂盒总体符合率为88.04%,符合率良好。本研究建立了一种特异性、灵敏性及重复性良好的BVDV抗体间接ELISA检测方法,为山东地区BVDV防控及临床检测提供了一种有效工具。

猪瘟病毒E^(rns)蛋白RNase活性与免疫抑制功能的相关性研究

猪瘟病毒Erns蛋白是具有多功能的结构蛋白,具有RNase活性和免疫抑制功能。为阐明猪瘟病毒Erns蛋白RNase活性与免疫抑制间的相关性,对决定RNase活性的2个关键氨基酸进行基因突变(297H→K和346H→K),使Erns丧失RNase活性。荧光素酶报告基因系统研究发现,失去RNase活性的Erns蛋白仍能抑制由新城疫病毒诱导的IFN-β启动子的活化作用。表明Erns蛋白的免疫抑制功能并不依赖于RNase活性。

基于加速加载试验的钢桥面铺装性能研究

为了对ERS钢桥面铺装体系的实际使用效果进行验证,本研究以嘉绍大桥项目为依托,采用路面加速加载系统对钢桥面铺装层的长期使用性能以及极端条件下的路用性能进行试验研究。试验发现,ERS和ERN两种结构轴载作用次数达205万次时,平均车辙深度增长的绝对值均不超过5 mm;试验加载次数超过130万次以后,两种桥面铺装结构基本不渗水,其抗滑性能也趋于稳定;加载次数超过80万次以后,铺装结构内部材料出现了疲劳损伤,弯拉应变出现明显增长,且横向最大拉应力大于纵向最大拉应力。而在高温湿热极端条件下,ERN结构在轴载作用次数达6万次时,超薄磨耗层开始出现推移剥落;ERS结构在轴载作用次数超过9万次后,SMA结构层迅速破坏。结果表明,ERS和ERN两种结构在自然条件下均未出现开裂或破损,具有优良的抗车辙性能;而在极端条件下,这两种结构都出现明显的滑移剪切破坏。相反,热固性的树脂沥青材料在极端条件下表现出了极佳的高温稳定性能,但其抗开裂性能有待进一步研究。横向拉应力引起的纵向裂缝是造成铺装层开裂破坏的主要原因,因此应将横向最大拉应力作为铺装层设计的重要控制指标。

错误相关负波(ERN)在精神病理学研究中的应用

错误相关负波(error-related negativity,ERN)是由行为错误诱发的一种脑电波成分,最大峰值在错误反应之后的50ms左右,偶极子源定位于前扣带回(anterior cingulate cortex,ACC)附近。错误加工(error processing)的经典研究范式中出现的ERN成分可能反映了ACC具有错误检测、冲突监控、强化学习、情绪动机等功能。大量研究表明过度的和不足的错误相关脑活动(hyperactive and hypoactive error processing)可能分别与精神病理学的内化性和外化性障碍(internalizing and externalizing disorders)相关联。内化性和外化性障碍的内表型(endophenotype)的研究,还存在许多值得进一步探索的问题。