结核分枝杆菌分泌蛋白早期分泌性抗原6(ESAT-6)的免疫学性质及其在新型疫苗中作用的研究进展

早期分泌性抗原6(ESAT-6)是结核分枝杆菌(MTB)关键的毒力因子,可通过抑制巨噬细胞的吞噬杀菌功能与自噬反应抵抗机体对MTB的清除,从而减弱机体对MTB感染的免疫防御功能。此外,ESAT-6诱导的巨噬细胞的凋亡与固有免疫细胞的大量坏死可促进MTB的扩散、定植,引发MTB的全身感染。ESAT-6还可抑制Th1细胞的保护性免疫反应从而抑制相关促炎细胞因子的分泌,引发机体免疫功能的紊乱,加速MTB感染进程。在这一感染过程中,ESAT-6所具备的高度免疫原性使其可作为优势抗原用于新型结核病(TB)疫苗的研制,具有广阔的发展前景。

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP-10在肺结核组织中的表达

目的:探究结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6、CFP-10在肺结核组织中的表达。方法:收集经病理学诊断的19例石蜡包埋肺结核组织标本,以20例正常肺组织(肺癌切除标本正常组织断端)为阴性对照,采用免疫组化检测ESAT-6及CFP-10,并与抗酸染色进行对比。结果:ESAT-6及CFP-10的阳性信号主要分布在结核病灶的坏死区域及其周围的巨噬细胞和多核巨细胞中,其分布与抗酸杆菌有关,范围更广。免疫组化检测ESAT-6的敏感度、特异度分别为73.68%、90.00%;CFP-10的敏感度和特异度分别为63.16%和95.00%;抗酸染色敏感度为52.63%,免疫组化的敏感度高于抗酸染色(P<0.05)。结论:采用免疫组化检测ESAT-6及CFP-10在结核诊断中有潜在的应用价值。

ESAT-6联合多项检测指标评估抗结核药物性肝损伤严重程度的关系

目的 检测ESAT-6联合IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18、MMP-7和MMP-9在抗结核药物性肝损伤(ATB-DILI)患者血清中的表达水平,分析上述指标与肝损伤严重程度的相关性,探讨7种因子对ATB-DILI的评估价值。方法 纳入2019年1月至2023年1月就诊于昆明市第三人民医院的肺结核患者,使用ELISA方法检测210例ATB-DILI的肺结核患者(A组)、120例抗结核治疗未发生肝损伤的肺结核患者(B组)及50例健康体检者(C组)血清中的ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18、MMP-7、MMP-9水平,分析上述指标与肝损伤严重程度的相关性,以及评估肝损伤严重程度的准确性。结果 3组人群一般检查结果比较,A组患者年龄高于B、C组(P <0.05)。与对照组比较,A组血清ESAT-6、IL-10、CK-18、MMP-7和MMP-9表达上调,B组ESAT-6和MMP-7表达上调(P <0.05)。其中,A组CK-18、IL-10和MMP-9的表达量高于B组(P <0.05)。A组的年龄、ESAT-6、CK-18和MMP-9与肝损伤严重程度呈正相关关系(P <0.05)。Logistic回归分析显示,A组患者年龄>65岁、ESAT-6>31.3 pg/m L、CK-18>45.5 ng/m L是ATB-DILI的独立危险因素。结论 高龄患者更易发生ATB-DILI,ESAT-6、CK-18和MMP-9升高与ATB-DILI严重程度有关。年龄>65岁、ESAT-6>31.3 pg/m L、CK-18>45.5 ng/m L是ATB-DILI的独立危险因素,联合检测高龄患者ESAT-6和CK-18表达水平,对预判及评估ATB-DILI严重程度具有较高的临床价值。

早期诊断结核性脑膜炎的新方法:检测浓缩脑脊液中CFP-10和ESAT-6

目的:应用酶联免疫吸附试验检测浓缩的脑脊液中结核分枝杆菌特异性抗原培养滤液蛋白10(CFP10)和6000早期分泌性抗原靶(ESAT-6),评价其在结核性脑膜炎(TBM)早期诊断中的价值。方法:应用ELISA测定46例临床诊断为TBM和56例非TBM患者脑脊液原液及经透析袋浓缩10倍的脑脊液浓缩液中CFP10和ESAT-6。结果:TBM患者脑脊液原液CFP10检测敏感度为13.04%、特异度为100.00%,ESAT-6的敏感度为13.04%、特异度为100.00%;而浓缩液CFP10的敏感度为78.26%、特异度为96.42%,ESAT-6的敏感度为76.09%、特异度为98.18%。结论:应用反透析方法浓缩脑脊液,使用抗CFP10和ESAT-6 ELISA检测脑脊液CFP10和ESAT-6能显著提高其敏感度,是一种简单、快速早期诊断结核性脑膜炎的有效辅助方法。

细胞因子IL-2、IL-12及IL-18增强结核杆菌ESAT-6 DNA疫苗的免疫保护作用

目的探讨白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(IL-12)以及白细胞介素-18(IL-18)对结核分枝杆菌ESAT-6DNA疫苗免疫保护作用的影响。方法50只雌性Balb/c小鼠随机分为IL-2-pcDNA-ESAT-6、IL-12-pcDNA-ESAT-6、IL-18-pcDNA-ESAT-6、pcDNA-ESAT-6以及PBS对照组,分别于0、2、4周共免疫3次。末次免疫2周后各组处死5只小鼠,ELISA检测小鼠血清IgG、IgA,并分别检测0、2、4、6周小鼠阴道灌洗液中sIgA水平。CCK-8法检测免疫小鼠脾细胞的增殖情况,并测定脾细胞上清中细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6、IL-10的分泌水平。末次免疫2周后,腹腔注射结核杆菌H37Rv感染小鼠,感染后4周取小鼠肺组织进行菌落培养计数;同时通过HE染色以及肺组织炎症因子检测评估其炎症情况。结果细胞因子IL-2、IL-12以及IL-18均能够显著增加小鼠血清IgG、IgA以及阴道灌洗液sIgA的分泌(P<0.05),并促进免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖(P<0.05);IL-2、IL-12及IL-18还能够显著增加脾细胞中IFN-γ、IL-2、TNF-α的分泌水平;此外,相较于ESAT-6真核疫苗组以及PBS对照组,IL-2、IL-12及IL-18均能够显著降低小鼠肺组织菌体载量以及炎性侵润,并减少炎性因子分泌。结论细胞因子IL-2、IL-12及IL-18均能不同程度的增强结核杆菌ESAT-6 DNA疫苗的体液以及细胞免疫应答水平,并显著提高其免疫保护效果。

结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合基因的表达及其多克隆抗体的制备

以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组DNA为模板,经重叠PCR扩增获得CFP10-ESAT-6融合基因片段,克隆于pET21a表达载体中,获得了重组质粒pET21a-CFP10-ESAT-6,将其转化大肠杆菌BL21细胞,经IPTG诱导表达,得到了25 ku的目的蛋白。表达产物经纯化和定量分析后免疫新西兰大白兔,收集兔血清进行抗体ELISA检测。结果显示,成功构建了CFP10-ESAT-6融合基因的原核表达质粒,获得了CFP10-ESAT-6融合蛋白,以此蛋白免疫动物可产生高效价的抗体。

牛结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的原核表达及其在牛结核病检测中的应用

采用重组PCR技术从牛结核分枝杆菌AN5基因组DNA中扩增CFP10-ESAT6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a,构建了原核表达质粒pET-CFP10/ESAT6。重组子经酶切及测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳鉴定,获得约42 ku带有6×His蛋白标签的rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的40%。用HIS蛋白纯化柱纯化该蛋白,Western-blot分析显示,该融合蛋白能与抗牛结核分枝杆菌阳性血清发生特异性反应。将重组的该融合蛋白用于刺激单次皮内变态反应阳性牛全血,可以产生高水平的IFN-γ,其特异性优于结核菌素。结果表明,获得的重组融合蛋白rHIS-CFP10/ESAT6为牛结核病的诊断奠定了基础。

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的 在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法 通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a为表达载体 ,构建重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达目的蛋白 ,通过SDS PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Westernblotting)鉴定rCFP10 ESAT6在大肠杆菌中的表达 ,确定rCFP10 ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式 ;采用ChelatingSepharoseFastFlow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白。West ernblotting及酶联免疫吸附试验 (ELISA)分析重组蛋白的免疫原性。结果 重组质粒pET2 8a CFP10 ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同 ;在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ;分子量约2 8kDa ,表达量约占菌体总蛋白的 4 6 % ,纯化后的rCFP10 ESAT6样品经SDS PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为 90 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 16mg左右的重组蛋白 ;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应。ELISA结果分析表明 ,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清。

复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在活动性肺结核辅助诊断中的价值

目的:评价结核分枝杆菌复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在活动性肺结核诊断中的应用价值。方法:选取初治肺结核病患者70例和健康体检者34例作为结核组和健康对照组,分离PBMCs,分别用复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库作为抗原进行ELISPOT实验,检测斑点形成细胞数。结果:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库检测结核分枝杆菌感染的阳性率依次为85.7%(60/70)、77.1%(54/70)、72.9%(51/70),特异性依次为82.4%(28/34)、85.3%(29/34)、88.2%(30/34)。结论:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315作为抗原建立的ELISPOT检测方法在活动性肺结核的辅助诊断中有较高的应用价值。

结核分枝杆菌esat-6基因疫苗的构建和免疫原性的研究

目的 构建以结核分枝杆菌H3 7Rvesat - 6基因为基础的基因疫苗 ,并研究其免疫原性。方法 采用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切含有esat- 6目的基因的质粒pGEM -Teasy -esat6 ,10 g L-1琼脂糖凝胶电泳回收约 30 0bp大小片段 ,以亚克隆法构建于真核表达载体 pcDNA3 1的相应酶切位点阳性克隆经酶切鉴定证实。重组表达质粒肌注免疫BALB/c小鼠三次 ,每次间隔 2周 ,ELISA检测小鼠血清中产生抗体的水平。结果 用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定证实目的基因正确插入载体 ,命名为pcDE6 ,重组质粒免疫小鼠体内产生特异性抗体。结论 所构建的重组真核表达质粒pcDE6能引起免疫动物的特异性体液免疫反应 ,应进一步研究其刺激机体的细胞免疫应答 ,以用于结核病 (TB)

结核分枝杆菌rdESAT-6抗原在耻垢分枝杆菌中的制备及其血清学诊断研究

目的构建结核分枝杆菌(MTB)融合基因2×esat-6原核表达载体,利用耻垢分枝杆菌诱导表达、纯化早期分泌抗原ESAT-6重组二聚体(rdESAT-6),Western blot分析其抗原性,并评估其在结核病患者中的血清学诊断价值。方法以DNA疫苗HG856A2为模板扩增2×esat-6基因,构建pMF41-2×esat-6原核表达载体,电转化耻垢分枝杆菌,诱导表达rdESAT-6蛋白,Western blot分析其抗原性。收集126例确诊的结核病患者和42名健康体检者的血清,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和结核斑点金免疫渗滤试验(TB-DOT)检测血清结核抗体,评估rdESAT-6在结核血清学诊断中的价值。结果成功构建了pMF41-2×esat-6重组质粒,以包涵体形式表达了rdESAT-6蛋白,纯化的蛋白纯度在95%以上,可与小鼠抗ESAT-6血清发生特异性反应。126例结核病患者血清检测结果表明,rdESAT-6蛋白在MTB阳性组和阴性组患者血清学诊断的敏感性分别为79.75%(63/79)、61.70%(29/47),好于TB-DOT的62.03%(49/79)、44.68%(21/47)(P<0.05)。2种方法对42名健康体检者血清诊断特异性均为95.24%(40/42)。结论 MTB的融合蛋白rdESAT-6用于结核病血清学检测具有较好的敏感性和特异性,可作为结核病血清学诊断的优选抗原。

ELISA法检测浓缩脑脊液ESAT-6对结核性脑膜炎的诊断价值

目的探讨酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测浓缩脑脊液结核分枝杆菌早期分泌性抗原6000(6000early secretory antigenic target,ESAT-6)对结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)的诊断价值。方法采用腰椎穿刺抽取106份脑脊液,其中49份来自TBM患者,57份来自非TBM患者。应用Amicon Ultra-4超滤离心管离心浓缩脑脊液。采用ELISA法检测脑脊液中ESAT-6含量。结果浓缩脑脊液ESAT-6抗原检出敏感性显著高于脑脊液原液的检出率(87.50%比67.35%,P<0.05),而其特异性与脑脊液原液比较无统计学差异(92.16%比96.49%,P>0.05)。结论应用离心超滤技术浓缩脑脊液能显著提高ELISA法检测脑脊液ESAT-6抗原的检出率,提高TBM的诊断率。

人IL-12与结核分枝杆菌抗原ESAT-6联合基因疫苗的免疫效果观察

人白细胞介素12（IL-12）与结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达质粒联合基因免疫,诱导免疫应答效果观察.近交系BALB/c小鼠,随机分组：A组（生理盐水对照）、B组（pcDNA3.1空质粒对照）、C组（BCG对照）、D组（pcESAT-6）和E组（pcIL-12＋pcESAT-6）.B、D、E质粒免疫组小鼠分别于胫前肌肌肉注射布比卡因（7.5g/L）和质粒的混和物（1：4,100μL,含质粒70μg/次）,A组小鼠肌肉注射生理盐水和布比卡因的混和物（1：4,100μL）,均间隔2周免疫一次,共免疫3次;末次免疫时,C组小鼠皮下注射BCG菌液,0.3mL/只,含10^6CFU/mL.末次免疫后14d和28d,各组小鼠分别取血分离血清用于总IgG测定,同时分离脾细胞,经TB-PPD刺激后检测脾细胞增殖（XTT比色法）活性和脾细胞培养上清液中γ干扰素（IFN-γ）、白介素4（IL-4）分泌水平.pcESAT-6质粒DNA单独免疫（D组）或与pcIL-12质粒DNA联合免疫（E组）,均能诱导小鼠产生特异性抗体,且抗体水平在末次加强免疫后14～28d逐渐增加;但pcIL-12与pcESAT-6联合免疫后,特异性抗体水平较pcESAT-6单独免疫增加不明显（P＜0.05）.c、D、E组免疫小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,E组小鼠特异性淋巴细胞增殖活性和IFN-γ分泌水平明显强于C组和D组（P＜0.05）,而IL-4分泌水平相互间未发现明显差异.末次加强免疫后14～28d,E组小鼠脾细胞增殖活性维持在较高水平,而C组小鼠脾细胞增殖活性先低后高,D组则先高后低;IFN-γ诱生水平,E组最高,C组次之,D组最低.pcIL-12与pcESAT-6质粒DNA联合免疫后能刺激机体产生强烈的细胞免疫和稳定的体液免疫,在动物体内诱发的细胞免疫较ESAT-6或BCG单独免疫时均有明显增加并维持较长时间,此外联合免疫后诱导的体液免疫也较BCG免疫有明显增加.

牛分枝杆菌esat-6和mpb70-mpb83基因DNA疫苗的免疫效果

用PCR技术和重叠延伸剪接技术获得牛分枝杆菌esat-6基因和mpb70-mpb83融合基因,连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了重组质粒pCE6和pC70-83-E6。分4组免疫小鼠:pCE6组、pC70-83-E6组、pcDNA3.1(+)和PBS对照组,采用间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况。结果表明,2重组质粒免疫组小鼠的血清抗体水平持续上升,而2对照组始终维持在较低水平,且pC70-83-E6组小鼠的抗体水平高于pCE6组。经PPD刺激后,pCE6组和pC70-83-E6组小鼠的SI值与2对照组均差异显著(P<0.05),2重组质粒免疫组间差异不显著(P>0.05);2重组质粒免疫小鼠脾细胞产生的IFN-γ均显著高于2对照组(P<0.05),且pC70-83-E6组明显高于其他3组(P<0.05)。证实本试验构建的2种牛分枝杆菌DNA疫苗可有效诱导实验动物产生体液免疫和细胞免疫应答。

B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗安全性及抗肿瘤效应研究

目的:评估B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗用于C57BL/6小鼠的安全性及其诱导的抗肿瘤免疫效应。方法:应用免疫荧光、FCM检测瘤苗细胞ESAT-6-GPI的表达情况;以Western blot方法检测瘤苗细胞IL-21的表达情况;动物实验检测瘤苗体内应用的安全性;制备荷瘤鼠术后免疫模型,评价瘤苗免疫效果。结果:B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗细胞表面有靶抗原ESAT-6-GPI表达,并分泌IL-21。于C57BL/6小鼠皮下接种2×105个B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗细胞,60天内未见致瘤,但能够诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫效应。结论:B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗致瘤性明显下降,低剂量应用具有安全性,能够诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫效应。

牛分枝杆菌ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中的融合表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得了ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6基因和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到了融合基因。将融合基因片段先克隆于pMD18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a(+)中,通过限制性内切酶消化、菌液PCR鉴定、序列分析证实得到含预期序列的重组质粒pET-ESAT-6-CFP-10;该质粒转化BL21(DE3);经IPTG诱导,表达出了40ku的融合蛋白;用Ni螯合层析方法纯化该蛋白,经SDS-PAGE检测,出现了清晰的单一条带;Western-blotting试验结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。结果表明,ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中融合表达成功并具有良好的反应原性。

分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗的构建和表达

目的构建分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗。方法PCR扩增结核分枝杆菌热休克蛋白60(hsp60)的调控序列和合成T4转录终止序列,分别定向克隆入pBCG2000载体的多克隆位点的上下游,得到E.coli-Mycobacterium穿梭载体质粒pBCG3000。PCR分别扩增出结核分枝杆菌分泌性抗原Ag85B的全编码序列及ESAT-6基因,然后将两基因融合插入pBCG3000载体的hsp60启动子下游得到pBCG3000-85B-ESAT-6分泌性表达质粒。用电穿孔法将pBCG3000-85B-ESAT-6质粒转化BCG细胞,得到重组卡介苗。重组卡介苗经热诱导后,SDS-PAGE电泳和Westernblotting鉴定融合蛋白85B-ESAT-6的表达及其免疫学活性。结果通过PCR、酶切以及测序鉴定,pBCG3000-85B-ESAT-6表达质粒构建完全正确,SDS-PAGE电泳未能直接观察到表达的融合蛋白条带,用ESAT-6蛋白的多抗血清通过Westernblotting证实了该蛋白主要分泌性表达于胞外并具有免疫学活性。结论分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗构建成功。

结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6的构建、鉴定及免疫效应评价

目的构建结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6并探讨其诱导的免疫效应。方法将扩增自结核杆菌基因组的ESAT-6基因装入pVAX1载体构建pVAX1/ESAT-6重组质粒;经酶切、测序鉴定后,利用阳离子聚合物介导将重组质粒pVAX1/ESAT-6转染Hela细胞,分别以RT-PCR法检测ESAT-6 mRNA的表达、间接免疫荧光法检测ESAT-6蛋白表达。重组质粒经体内电转染免疫小鼠后,采用ELISA法测定小鼠血清中IFN-γ及抗ESAT-6特异性抗体IgG的水平;流式细胞术检测小鼠淋巴细胞增殖水平;ELISPOT检测产生IFN-γ的淋巴细胞频数。结果构建的重组质粒pVAX1/ESAT-6经双酶切于3000 bp和300 bp处各见1条带,测序结果显示插入序列与ESAT-6基因序列无差异。重组质粒转染Hela细胞后,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳于约300 bp处见目的条带,间接免疫荧光检测显示特异性绿色荧光。重组质粒免疫小鼠后,血清中抗ESAT-6特异性抗体IgG水平较对照组(空质粒组和生理盐水对照组)明显升高;血清中IFN-γ水平、小鼠脾淋巴细胞增殖水平及产生IFN-γ的淋巴细胞数明显均高于对照组(空质粒组和生理盐水对照组)。结论成功构建了结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6,该疫苗可有效诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫效应。

脑脊液单核细胞内ESAT-6检测对结核性脑膜炎的诊断意义

目的评价检测脑脊液中单核细胞内的早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)对结核性脑膜炎诊断的意义,为结核性脑膜炎的诊断提供有效的方法。方法将20例结核性脑膜炎患者与20例对照组患者进行脑脊液常规、生化、细胞学检查,同时用免疫组化的方法检测脑脊液单核细胞内的ESAT-6及PPD。结果结核性脑膜炎患者单核细胞内存在ESAT-6,在20例结核性脑膜炎患者中14例显示阳性,对照组中1例阳性,结核性脑膜炎组单核细胞内ESAT-6阳性检出率显著高于对照组,(P<0.05),该方法诊断结核性脑膜炎敏感性为70%,特异性为95%,约登指数0.65。结核性脑膜炎组单核细胞内PPD阳性检出率显著高于对照组,(P<0.05),敏感性为0.65,特异性为0.90,约登指数为0.55。结论检测脑脊液单核细胞中ESAT-6是诊断结核性脑膜炎的一种简便、特异的方法 。

玉米特异启动子驱动下结核Hsp65与Esat-6融合基因表达载体的构建及鉴定

利用转基因玉米研制新型结核口服疫苗。构建植物双元表达质粒pCAMBIA1300GHLE,并转化农杆菌LBA4404。以本实验室构建的pEGHLE为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65-Esat6基因,连接到含有玉米特异性启动子globulin-1的pCR2.1载体上;将globulin1-HLE联合片断切下连到含有抗除草剂基因bar的pCAMBIA1300载体中;电击法将重组质粒转化到农杆菌LBA4404中。成功构建了pC1300GHLE质粒,酶切鉴定得到3.3 kb和8.6 kb 2条带,测序分析表明克隆的Hsp65和Esat6序列与NCBI上公布序列一致;成功转化到农杆菌中,酶切从农杆菌中所提的质粒,条带大小与预期结果相符合。成功构建和转化了pC1300GHLE表达载体,为成功研制利用转基因植物生产抗结核口服疫苗奠定了基础。