结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP-10在肺结核组织中的表达

目的:探究结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6、CFP-10在肺结核组织中的表达。方法:收集经病理学诊断的19例石蜡包埋肺结核组织标本,以20例正常肺组织(肺癌切除标本正常组织断端)为阴性对照,采用免疫组化检测ESAT-6及CFP-10,并与抗酸染色进行对比。结果:ESAT-6及CFP-10的阳性信号主要分布在结核病灶的坏死区域及其周围的巨噬细胞和多核巨细胞中,其分布与抗酸杆菌有关,范围更广。免疫组化检测ESAT-6的敏感度、特异度分别为73.68%、90.00%;CFP-10的敏感度和特异度分别为63.16%和95.00%;抗酸染色敏感度为52.63%,免疫组化的敏感度高于抗酸染色(P<0.05)。结论:采用免疫组化检测ESAT-6及CFP-10在结核诊断中有潜在的应用价值。

复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在活动性肺结核辅助诊断中的价值

目的:评价结核分枝杆菌复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315在活动性肺结核诊断中的应用价值。方法:选取初治肺结核病患者70例和健康体检者34例作为结核组和健康对照组,分离PBMCs,分别用复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库作为抗原进行ELISPOT实验,检测斑点形成细胞数。结果:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库检测结核分枝杆菌感染的阳性率依次为85.7%(60/70)、77.1%(54/70)、72.9%(51/70),特异性依次为82.4%(28/34)、85.3%(29/34)、88.2%(30/34)。结论:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv0315作为抗原建立的ELISPOT检测方法在活动性肺结核的辅助诊断中有较高的应用价值。

牛分枝杆菌ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中的融合表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得了ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6基因和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到了融合基因。将融合基因片段先克隆于pMD18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a(+)中,通过限制性内切酶消化、菌液PCR鉴定、序列分析证实得到含预期序列的重组质粒pET-ESAT-6-CFP-10;该质粒转化BL21(DE3);经IPTG诱导,表达出了40ku的融合蛋白;用Ni螯合层析方法纯化该蛋白,经SDS-PAGE检测,出现了清晰的单一条带;Western-blotting试验结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。结果表明,ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中融合表达成功并具有良好的反应原性。

牛分枝杆菌广西分离株CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的克隆与序列分析

根据GenBank上牛分枝杆菌(M.bovis)CFP-10、ESAT-6、MPB70的基因序列,设计并合成了3对扩增CFP-10、ESAT-6、MPB70基因的特异性引物,扩增片段大小分别是321、306、582bp。对牛分枝杆菌广西分离株MBT359进行以上3个基因的克隆、序列测定及分析,结果显示,可以从广西分离株MBT359扩增出大小与预期相符的基因片段,经测序证实,扩增出的片段即为3个目的基因片段。序列分析表明,广西分离株MBT359的CFP-10、ESAT-6、MPB70基因片段与国际标准强毒株AF2122/97相应基因核苷酸同源性为100%。该研究结果为广西牛分枝杆菌流行株主要基因测序、建立广西牛结核病流行株遗传多态性数据库奠定了基础。

牛分枝杆菌ESAT-6-CFP-10融合基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建表达牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,为研制能有效防治牛结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到融合基因。将融合基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-CFP-10,限制性内切酶消化、菌液PCR、序列分析验证无误后,PmeⅠ酶切,转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-ESAT-6-CFP-10。PacI酶切线性化的重组质粒pAd-CMV-ES-AT-6-CFP-10转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。PCR、Western blot检测包装病毒的融合基因及其表达情况。结果成功构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,包装病毒用PCR、Western blot检测到包装病毒的融合基因及其表达。结论本研究成功地构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒,为下一步在动物体内进行免疫效果研究打下基础。

CFP-10/ESAT-6特异性IFN-g释放反应诊断活动性肺结核的研究

前期研究已经建立了基于结核分枝杆菌特异性抗原CFP-10/ESAT-6融合蛋白刺激外周血单核细胞IFN-γ释放反应,本研究旨在证实该方法在活动性肺结核及结核菌潜伏感染诊断中的意义。实验对象包括111例当地医院收治的活动性肺结核病人(病例组)及283例某大学入学新生(健康对照者)。采集肝素抗凝血,分别加入含结核菌抗原CFP-10/ESAT-6、植物血凝素及无刺激物(PBS)的细胞培养孔中,培养过夜,次日收集血清,进行IFN-γ检测。同时,对其中58位病人志愿者及46位健康对照志愿者进行了结核菌素(PPD)皮内变态反应。病例组与健康对照组的PPD皮内变态反应阳性率分别为79.3%(46/58)和76.1%(35/46),无显著差异(P>0.05),表明PPD皮内变态反应不能用于活动性肺结核的检测。病例组IFN-γ体外释放反应的阳性率为95.5%(106/111),而健康对照组阳性率为16.3%(46/283),两组间均存在极显著差异,表明IFN-γ体外释放反应诊断活动性肺结核具有很高的灵敏度(95.5%)与良好的特异性。在健康组中,IFN-γ体外释放反应与PPD皮内变态反应的总符合率为50.0%,且IFN-g体外释放反应阳性者中,83.3%为PPD皮内变态反应阳性;在病例组中,二者的总符合率为72. 4%,IFN-g体外释放反应阳性者中,77.8%为PPD皮内变态反应阳性。CFP-10/ESAT-6特异性IFN-γ体外释放反应诊断活动性肺结核具有很高的灵敏度与特异性,PPD皮内变态反应由于受卡介苗免疫等因素影响在我国不能用于诊断活动性肺结核病与结核菌感染。

融合蛋白Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用

本研究通过融合表达Rv3872、CFP-10和ESAT-6蛋白,以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法,克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接。融合基因在大肠杆菌内经IPTG0.4mmol/L诱导3h,目的蛋白经SDS-PAGE证实表达在上清中,Western-blot分析证实表达蛋白具有免疫原性。以所表达的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA,检测了44份牛分枝杆菌感染背景清楚的临床奶牛血清。26份阳性血清中,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA检出阳性样本18份,检测灵敏度为69%,而CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA只检出阳性样本4份。18份阴性血清中,两种ELISA均检出17份阴性血清,特异性都为94%(17/18)。因此,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白在对牛结核抗体检测特异性没有降低的情况下,敏感性获得了显著提高,这对牛结核病的早期鉴别诊断方法的建立具有重要意义。

参麦注射液对COPD合并肺结核患者细胞因子及ESAT-6/CFP-10水平的影响

目的探讨参麦注射液对慢性阻塞性肺疾病（COPD）合并肺结核患者细胞因子及ESAT-6/CFP-10水平的影响。方法选取本院呼吸科收治的COPD合并肺结核患者158例,按随机数字表法分组,对照组79例予以常规治疗,研究组79例在对照组基础上予以参麦注射液治疗,观察并记录2组间血清ESAT-6蛋白、CFP-10蛋白、IFN-γ水平、细胞因子水平、外周血免疫细胞水平,同时比较临床疗效及病灶吸收有效率。结果对照组临床总有效率（84.81%）低于研究组临床总有效率（94.94%）,差异具有统计学意义（P〈0.05）;对照组病灶吸收有效率（87.33%）低于研究组病灶吸收有效率（96.21%）,差异具有统计学意义（P〈0.05）;与对照组比较,研究组治疗后血清ESAT-6蛋白、CFP-10蛋白、IFN-γ水平较低,治疗后血清TNF-α、IL-6、s IL-2R水平较低,治疗后外周血NK细胞、CD4~＋T淋巴细胞及CD4~＋/CD8~＋水平较高,CD8~＋T淋巴细胞水平较低,差异均具有统计学意义（P〈0.05）。结论参麦注射液能够明显降低COPD合并肺结核患者血清TNF-α、IL-6、s IL-2R及ESAT-6/CFP-10水平,改善细胞免疫功能,有效促进病灶吸收,提高临床疗效。

复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c ELISPOT辅助诊断活动性肺结核的应用价值

目的:评估结核分枝杆菌复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c在活动性肺结核诊断中的应用价值。方法:选取肺结核病患者78例,非结核性肺部疾病患者27例和健康体检者39例,分别用复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库作为抗原刺激单个核淋巴细胞(PBMCs),采用酶联免疫斑点试验检测斑点形成细胞数,判断肺结核感染情况。结果:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c、ESAT-6肽段库和CFP-10肽段库检测结核分枝杆菌感染的敏感性依次为87.2%(68/78)、80.8%(63/78)、76.9%(60/78),特异性依次为81.8%(54/66)、84.8%(56/66)、87.9%(58/66)。结论:复合抗原ESAT-6/CFP-10/Rv3615c有较高的敏感性和特异性,对活动性肺结核的辅助诊断有一定的临床应用价值。

Rv3872/CFP-10/ESAT-6融合蛋白的人工合成及表达

根据牛分枝杆菌AF2122/97基因组中Rv3872、CFP-1O和ESAT-6全长基因序列,以柔性linke(rG4S)3,将三基因序列进行串联,形成表达基因盒(Rv3872-CFP1O-ESAT6,RCE),人工合成并克隆于PUC57转移载体上(PUC57-RCE)。经EcoRI和HindIII双酶切PUC57-RCE,回收纯化RCE片段,与经过相同双酶切的pET-28a载体,于16℃水浴连接过夜,连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,重组质粒经培养鉴定,测序结果证实插入的REC片段序列编码和方向与预期一致。在优化的诱导条件下表达蛋白,分段收集样本,并各取少量进行SDS-PAGE,经Western-blot分析显示,融合蛋白RCE具有较好的免疫原性,与阳性牛血清在35kDa位置处有明显的反应带。

ESAT-6及CFP-10刺激颗粒酶B在儿童结核诊断中的价值

目的探究结核特异性抗原ESAT-6/CFP-10刺激外周血单个核细胞后颗粒酶B(GrB)水平对儿童活动性结核(ATB)的诊断价值。方法选取2019年1-8月武汉市金银潭医院和武汉儿童医院86例儿童,[ATB 26例、结核潜伏感染(LTBI)20例、非结核病对照(Non-TB)20例,健康对照(HC)20例],ELISA检测ESAT-6/CFP-10刺激外周血单个核细胞后GrB水平,流式细胞术检测表达GrB和干扰素-γ(IFN-γ)的CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞比例。结果ESAT-6/CFP-10刺激后结核组特异性GrB较对照组显著升高(P<0.001),且LTBI组显著高于ATB组(P<0.001)。CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞均可分泌GrB。结论结核特异性GrB对儿童活动性结核的鉴别诊断可能具有重要价值。

ESAT-6和CFP-10在感染性脊椎炎鉴别诊断中的作用

目的探讨结核感染T细胞试验(T-SPOT.TB)中两种抗原6 kD早期分泌靶向抗原(ESAT-6)及10 k D培养滤过蛋白(CFP-10)在感染性脊椎炎鉴别诊断中的价值。方法回顾性分析2014年7月到2017年7月就诊于我院,完成T-SPOT.TB及相关检查,最终均通过血培养、病理组织学和脓液培养等手段明确病原学诊断的患者共59例(结核性脊椎炎38例、布鲁氏菌性脊椎炎11例和化脓性脊椎炎10例)。绘制ROC曲线并分析ESAT-6、CFP-10在不同类型感染性脊椎炎中的作用;应用kappa一致性分析检验ESAT-6、CFP10在结核性脊椎炎患者中诊断的一致性。结果 ESAT-6敏感度为84.2%、特异度为90.5%;CFP-10敏感度为76.3%、特异度为100%。两种斑点计数结果具有较高的一致性(kappa=0.660,P <0.05),但ESAT-6与病原学诊断结果一致性更高。结论 ESAT-6具有较高的可信度可运用于感染性脊椎炎的鉴别诊断。

结核菌特异性抗原ESAT-6及CFP-10在肺结核及肺炎患者中的诊断价值

目的分析结核菌特异性抗原ESAT-6及CFP-10在肺结核及肺炎患者中的诊断价值。方法将48例肺结核患者作为观察组,30例肺炎患者作为对照组,分别进行PPD及ELISA实验,对两组患者的结核菌特异性抗原在两种疾病中的诊断价值进行分析。结果经ELESA实验检测,观察组结核菌阳性率、特异度及灵敏度分别为87.50%、93.75%、89.58%;对照组结核菌阳性率、特异度及灵敏度分别为60.00%、66.67%、70.00%;组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。经PPD实验检测,观察组结核菌阳性率、特异度及灵敏度分别为45.83%、50.00%、47.92%;对照组结核菌阳性率、特异度及灵敏度分别为46.67%、50.00%、53.33%;组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论采用ELISA法对肺结核及肺炎患者ESAT-6及CFP-10抗原进行检测可鉴别两者的不同,与PPD法相比,ELISA法在肺结核及肺炎的鉴别中诊断价值更优。

结核分枝杆菌毒力因子ESAT-6和CFP-10的研究进展

ESAT-6和CFP-10是结核分枝杆菌中含量丰富的毒力因子,分别由RD1区相邻的基因esxA和esxB编码,二者可以协同转录形成紧密二聚体。此二聚体在破坏宿主的免疫应答、发挥毒性、参与吞噬溶酶体到宿主细胞质的易位、激活嗜中性粒细胞发挥趋化作用等生物学作用中扮演着重要角色。ESAT-6和CFP-10有良好的免疫原性,可应用于结核病的诊断和疫苗研究。进一步探索它们的分子结构和致病机制可为结核病的预防、诊断和治疗提供新思路。

牛结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的原核表达及其在牛结核病检测中的应用

采用重组PCR技术从牛结核分枝杆菌AN5基因组DNA中扩增CFP10-ESAT6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a,构建了原核表达质粒pET-CFP10/ESAT6。重组子经酶切及测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳鉴定,获得约42 ku带有6×His蛋白标签的rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的40%。用HIS蛋白纯化柱纯化该蛋白,Western-blot分析显示,该融合蛋白能与抗牛结核分枝杆菌阳性血清发生特异性反应。将重组的该融合蛋白用于刺激单次皮内变态反应阳性牛全血,可以产生高水平的IFN-γ,其特异性优于结核菌素。结果表明,获得的重组融合蛋白rHIS-CFP10/ESAT6为牛结核病的诊断奠定了基础。

牛分支杆菌CFP-10的原核表达及其在牛结核病诊断中的应用

低分子质量的蛋白抗原CFP-10是一种重要的牛分支杆菌早期分泌蛋白。为了检测该蛋白和其他几种抗原在牛结核病诊断中的临床应用,对CFP-10的基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达。PCR法扩增cfp-10基因片段,连接到pET-22b(+)原核表达载体中,再转入表达宿主E.coliBL21(DE3)PlysS菌株内,用IPTG诱导,进行蛋白表达、纯化。分别以CFP-10、ESAT-6、MPT83、MPT70、牛PPD、CFP-10与ESAT-6混合蛋白,MPT83与MPT70混合蛋白为抗原,用间接ELISA法诊断牛结核病。结果表明,以CFP-10与ESAT-6混合蛋白作为抗原检测牛结核病的特异性和敏感性分别达到了100%和63.6%,均超过了其他单抗原或抗原组合,为以筛选合适抗原为基础的血清学诊断技术提供了有力的支持并创造了良好的应用前景。

结核杆菌CFP10和ESAT6真核表达载体双转染真核细胞的观察

为了构建结核分枝杆菌两个毒力因子CFP-10基因和ESAT-6基因共同表达的真核细胞模型,本实验采用脂质体转染方法,将重组表达载体CFP-10-PDs Red1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1同时转染真核细胞293FT,通过倒置荧光显微镜和激光共聚焦观察,并经western blot检测分析。结果显示,经双转染的293FT细胞能够分别发出红色和绿色荧光,既能表达CFP-10,又能表达ESAT-6,且表达的蛋白分布于细胞质中,表明模型构建成功。由此可知,构建的这个细胞模型为进一步研究这两种毒力因子在宿主细胞中的作用机制奠定了基础。

ESAT-6/CFP-10融合蛋白的抗原性分析及其对诊断结核临床应用价值

目的分析ESAT-6/CFP-10融合蛋白作为结核抗原的特性,并探讨以其作为抗原的酶联免疫斑点实验(ELISPOT)在结核诊断中的应用价值。方法以ESAT-6/CFP-10融合蛋白为刺激抗原的ELISPOT法(ESAT-6/CFP-10-ELISPOT)检测经结核特异性抗原刺激后分泌γ干扰素的效应T淋巴细胞数量方法,测定65例单纯结核病患者,16例HIV/结核双重感染患者,20例HIV感染患者,32例非结核呼吸道疾病患者,30名健康体检者外周血单个核细胞中结核菌抗原特异的T淋巴细胞的频率。结果 ESAT-6/CFP-10-ELISPOT与结核菌素皮肤试验(TST)在所有81例结核患者中的比较,ESAT-6/CFP-10-ELISPOT阳性率98.8%,TST阳性率为56.8%;ESAT-6/CFP-10-ELISPOT在涂阳结核组、涂阴结核组、HIV/结核双重感染组阳性率分别为100.0%、97.1%、100.0%,其敏感性远高于痰涂片检查,且各组结果差异无统计学意义;20例HIV感染组有1例阳性,非结核呼吸道疾病患者组与健康对照组均为阴性,提示ESAT-6/CFP-10-ELISPOT方法的特异度为98.8%。结论ESAT-6/CFP-10融合蛋白可以很好的刺激效应T淋巴细胞分泌γ干扰素,适合作为结核诊断中的特异性抗原,因而可以用于ELISPOT的检测,ESAT-6/CFP-10-ELISPOT对结核诊断有应用价值。

结核杆菌CFP-10／ESAT-6融合基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其抗原性的初步研究

目的构建表达结核分枝杆菌CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,并观察其对巨噬细胞的作用。方法采用SOE法构建CFP-10／ESAT-6融合基因,克隆人大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261中,将重组质粒电转化耻垢分枝杆菌,SDS-PAGE检测CFP-10／ESAT-6融合蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞一氧化氮合成酶的表达水平。结果经DNA测序证实CFP-10／ESAT-6融合基因序列正确。重组耻垢分枝杆菌经热诱导后可以表达相对分子质量(Mr)约为18×103的融合蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导小鼠巨噬细胞表达一氧化氮合成酶。结论表达CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌构建成功,该重组耻垢分枝杆菌能够活化巨噬细胞,具有抗原性,为研制结核疫苗提供一定参考。

牛分枝杆菌CFP-10和ESAT-6基因的融合表达及其抗原活性鉴定

CFP-10和ESAT-6是牛分枝杆菌的免疫优势抗原,可诱导机体产生IFN-γ,在牛结核病的免疫诊断中发挥重要作用。本试验分别克隆了牛分枝杆菌CFP-10和ESAT-6基因,并将这2个基因融合扩增,构建重组表达质粒pET28a/CFP-10-ESAT-6,重组质粒在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达。重组蛋白主要以分泌表达的形式存在于表达上清中,收集上清中的目的蛋白进行Ni亲和层析柱和分子筛两步纯化,蛋白纯度分别达到90%和95%。将纯化的重组蛋白以2mg/L的质量浓度包被酶标反应板,用间接ELISA方法检测不同来源牛血清中的结核病抗体,结果表明,表达的重组融合蛋白具有良好的抗原活性,可有效识别阴、阳性结核病血清。