用EST-SSRs研究小麦遗传多样性

小麦EST-SSRs是从小麦ESTs序列(表达序列标签)中开发的一种新型SSR标记。研究采用35对小麦EST-SSRs标记检测了 96份小麦材料的遗传多样性。结果表明,这些小麦EST-SSRs引物均可获得清晰的预期产物,共检测到129个等位变异,其中87.6%有多态性,大多数引物有2～4个等位变异;其中部分引物可用于普通小麦及其近缘种属的亲缘关系研究,并可根据特征带谱鉴定部分小麦品种;在相似系数为0.745的水平可将人工合成双二倍体小麦材料和一般小麦品种区分开来。与基因组SSR标记相比,EST-SSRs这种新型分子标记来源于表达基因,将其用于小麦遗传研究可直接反映相关基因在不同小麦品种间的表达差异。

鲤与生长性状相关的EST-SSRs标记筛选

以大头鲤(Cyprinus pellegrini Tchang)(母本)与荷包红鲤(Cyprinus carpio wuyuanensis)抗寒品系(父本)杂交产生的F1作为亲本,以其自交F2作为分离群体,结合"拟测交"策略,用EST-SSRs标记对其中92个个体进行基因型检测。利用Windows Map Manager2.0的标记回归法对符合拟测交分离的70个EST-SSRs标记进行单标记回归分析,检测出8个与鲤体长、体高、体厚性状相关的标记。对同一标记不同基因型个体间生长性状进行显著性比较,通过t检验,找到与生长性状相关的基因型。将上述8个EST序列与GenBank数据库进行BLAST比对,有3条EST序列与蛋白库中已知功能的序列高度同源。其中HLJE225与编码斑马鱼(Denio rerio)冷诱导基因RNA结合蛋白的基因同源性水平高达97%,HLJE222与编码斑马鱼DAZ相关蛋白1基因同源性水平也高达97%,HLJE599与编码斑点叉尾(Ictalurus punctatus)核糖体蛋白L6基因的同源水平为87%。本研究鉴定的与鲤生长性状相关的功能基因及有利用价值的基因型,为鲤重要生长性状的QTL(数量性状基因座)定位和分子标记辅助育种提供了一定的依据。

茶树EST-SSRs分布特征及引物开发

为了在茶树中开发EST-SSRs功能性标记，利用生物信息学方法对NCBI网上公开的3288奈茶树（Camellia subebsus）ESTs序列进行EST-SSRs特征分析。剔除冗余序列，得到非冗余序列2083条。在非冗余序列中发现含不同重复基元SSRs的EST序列有385条，共486个EST-SSRs，平均相隔2．10kb出现1个SSR。在2～6bp的重复基元中，二核苷酸重复基元的SSRs出现频率最高（51．97％），其次是三核苷酸（19．55％）。对所有的重复基元类型进行统计分析发现，所占比例最高的是AG／CT（47．74％），其次分别是AT／TA（4．73％）和AAG／CTT（4．73％）。利用Prime5软件，设计了206对EST-SSRs引物，随机选用72对引物进行SSR扩增，发现31对引物可以扩增出条带，其中29对引物具有多态性，多态性比率为93．5％。这些EST-SSRs将有助于茶树基因组学方面的研究。

蒺藜苜蓿EST-SSRs分布特征及标记的开发

利用蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)EST数据库开发新的EST-SSRs标记,分析EST-SSRs的分布特征。利用SSRIT软件对NCBI上公布的285 285条蒺藜苜蓿EST序列进行SSR序列的检测,共检测出6 688个SSR序列,分布于6 512个EST中,占整个EST数据库的2.28%。其中二核苷酸重复基元出现的频率最高,占总EST-SSRs的34.4%(2 301条),其次是三核苷酸重复基元,占29.6%(1 982条),4～6核苷酸重复基元所占比例均较小。利用Pri mer Premier 5.0随机设计100对EST-SSRs引物,PCR扩增结果表明,85对引物在蒺藜苜蓿RIL群体亲本A17和A20上有清晰的扩增条带,占合成引物总数的85%,在RIL-8群体中检测到29个EST-SSRs引物有多态性,占可扩增引物的34.1%。本研究开发了85个蒺藜苜蓿EST-SSRs新标记。

橡胶树EST-SSRs发掘研究

随着橡胶树大量ESTs序列的产生,为EST-SSRs发掘提供了丰富的公共序列资源。本研究首先将11809条橡胶树ESTs组装成3932条非冗余序列,其中323条ESTs检索到SSRs358个,SSRs出现的频率为9.1%。SSR重复单元共93种,其中二核苷酸重复(57.5%)、三核苷酸重复(26.0%)和六核苷酸重复(12.8%)占所有重复单元的96.3%。对323条SSR-ESTs进行特异扩增引物设计,共获得158对引物,对48份包括31份魏可汉种质、12份1981'野生种质、2份色宝橡胶、2份光亮橡胶和1份少花橡胶扩增,其中60对引物扩增出1条预期长度DNA片段,占所有设计引物的38%,并筛选到40对具有多态性的引物。EST-SSRs标记的发掘为巴西橡胶树分子辅助育种、种质资源功能遗传多样性分析等研究提供了良好的标记。

利用EST-SSRs标记分析巴西橡胶树魏克汉种质的遗传多样性及遗传分化

橡胶树魏克汉（Wickham）种质是指1976年英国人魏克汉在亚马逊河下游与塔帕若斯（Tapajos）河汇合处的博因（Boim）采集并培育46株母树繁殖的后代中选出的初生代及其后杂交的次生代至多生代栽培品种。本研究利用25对EST-SSRs引物,对中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃中保存的来自6个国家的278份魏克汉种质进行遗传多样性和遗传分化分析。种质总群体共检测出等位变异103个,平均等位基因数（Na）4.12个,稀有等位基因占全部等位基因的14.56%;平均期望杂合度（He）值和Nei平均多样性指数（H）值分别为0.4108和0.4100;聚类分析得到种质个体间的遗传距离（GD）为0~1.1632。不同国家种质群体间的遗传多样性指数（H）值：巴西〉斯里兰卡〉印度尼西亚〉中国〉马来西亚〉泰国,但经SPSS非参数检验表明6个国家群体之间的种质遗传多样性水平差异并不显著;不同国家种质群体间的遗传一致度（GI）为0.9812~0.9869,与中国种质的亲缘关系最近的是印度尼西亚、其次马来西亚、泰国、斯里兰卡、巴西;仅3%的遗传变异来源于不同国家种质群体间,不同国家种质间的平均基因流（Nm）为4.463,大而通畅的基因流是橡胶树6个国家群体间遗传分化水平很低的主要原因。研究结果表明,中国国家橡胶树种质资源圃保存的魏克汉种质的遗传多样性较差,但通过EST-SSRs可检测到丰富的稀有等位基因。虽然不同国家种质交流频繁,导致种质之间和不同国家来源种质之间遗传距离非常近,但是,种质之间和不同国家来源种质之间依然存在一定的遗传分化,特别是巴西种质与中国种质遗传距离最远,基因流最小,遗传多样性最为丰富。

基于EST-SSRs的巴西橡胶树魏克汉种质核心种质构建研究

橡胶树魏克汉种质是目前橡胶树栽培品种的主要来源,主要来源于魏克汉培育46株母树繁殖的后代,亲缘关系较近。通过对289份资源EST-SSRs分析及基于EST-SSRs位点的多样性,结合种质资源来源和特殊农艺性状,构建包含27份种质的橡胶树魏克汉种质核心种质库,占原群体10%,主要来源于中国(16份)和巴西(6份)。核心种质库与原群体相比,总等位基因数保持不变,遗传多样性指数、多态信息含量、杂合度等高于原群体,基因型数目和主要等位基因频率较原群体低,较好地代表了原群体的遗传多样性。同时,核心种质农艺较为丰富,包含了高产、速生、抗寒等种质。

茶树EST-SSRs特点及应用

利用NCBI公共数据库下载获得的3 306条茶树EST,去除其中低质量和冗余的序列,得到全长为635.46 kb的1 335条无冗余EST,在这些序列中共发现216个SSR,分布于185个EST中,出现的频率为16.18%,平均每2.94 kb的表达序列中有1个SSR。茶树的EST-SSR类型丰富,其中二核苷酸重复出现的频率最高,占主导地位。利用Primer 5.0软件从185条含有SSR的EST中设计引物100对,从中随机选取60对引物检测EST-SSR在云南茶树资源中的多态性。结果表明,有30对引物在供试的63份茶树资源中得到有效扩增,并具有多态性;共检测到等位基因数71个,每对引物检测出的等位基因数2~8个,平均4.9个;多态信息量（PIC）变幅为0~0.731,平均为0.499;观察杂合度变幅为0~0.970,平均0.392。EST-SSR标记分析表明云南茶树资源具有较高的遗传多样性。

基于ESTs序列的杨树木质部形成相关EST-SSRs标记的开发与应用

ESTs数据库的发展为分子标记的开发提供了宝贵的资源。本研究从NCBI下载与杨树木质部形成相关的5359条ESTs序列,在其中257条序列中检测到279个SSRs位点,检出率为5.2%。全部SSRs共分为84种重复单元,平均长度18.2bp,变幅为15～36bp,平均分布频率1/6.94kb。所有类型中三核苷酸重复单元占总SSRs的41.3%,处于主导地位。AAG占三核苷酸重复单元的比例为27.0%,是三核苷酸重复单元中的优势重复类型。利用primer3在线设计引物,通过生物信息学方法筛选出7对引物,其中6对扩增效果较好。利用筛选出的引物对19个杨树无性系进行扩增,每对引物产生多态性条带数目为3～6条,平均4.16条。引物多态信息量变化范围为0.2267～0.9845,平均0.5485。应用NTSYS软件在相似系数为0.68水平可将19个杨树无性系准确聚类。研究结果表明,利用ESTs序列进行SSRs的开发是一种切实有效的方法,为EST-SSRs在杨树遗传图谱构建以及遗传多样性等方面的应用奠定了基础。

鲫体重和体厚相关的EST-SSRs标记筛选及同源基因分析

利用300个EST-SSRs标记对普通二倍体鲫(Carassius auratus)自交F2代的181个个体进行基因型检测,并对其体重、体厚两种经济性状进行单标记回归分析。Permutation检验(10 000次)结果显示,38个标记与所检测的经济性状相关,其中26个标记达到显著性相关(P<0.05),12个标记达到极显著性相关(P<0.01)。在38个相关标记中,有27个标记与体重相关,25个标记与体厚相关,14个标记与体重、体厚均相关。对同一标记的不同基因型之间进行多重比较,找到了与两种经济性状相关的基因型。将与性状相关的38个标记与斑马鱼(Da-nio rerio)基因组序列进行BLAST同源性比对,找到10条相似性高且功能已知的EST-SSRs序列(E<e-20)。其中,JE594与斑马鱼膜结合环指蛋白基因march7相似性高达95%,JE3165与斑马鱼肌盲蛋白基因mbnl1的相似性达78%,JE6996与斑马鱼促蛋白激酶的基因mapk10的相似性高达98%,JE4984与斑马鱼蛋白磷酸酶的基因ppp1cab相似性达84%。本研究筛选出了与鲫体重、体厚相关的EST-SSRs标记及基因型并找到了与鲫生长相关的候选功能基因,为鲫的分子标记辅助育种(MAS)及目标性状的遗传改良提供依据。

小麦EST-SSRs分子标记的特性及其遗传作图(英文)

为了解普通小麦EST来源的微卫星的多样性,从大约1 000个包含微卫星的ESTs中设计了300对引物,研究和评估了它们的多态性水平,并且将多态性标记加入到现有的遗传图谱中。在五种不同类型的重复单元中,三个碱基的重复单元出现最多,占到77%。几乎所有的EST-SSRs标记(99.3%)的重复单元都含有G-C碱基对。37.4%的微卫星都是四次重复。对于扩增和多态性,300对引物中有60对没有扩增,21.3%的扩增引物没能产生预期的扩增片断。58%的标记至少在所用8个材料的一个中显示出多态性。W7984和Opata组合表现出最高的多态性水平。大多数普通小麦EST-SSRs标记的重复次数小于10,并且4次重复是最为普遍的。81个新的EST-SSR位点被添加到两个已有的参照遗传图谱中(62个加到ITMI,19个加到CTCS)。研究结果表明小麦EST-SSRs标记展示了一些不同于基因组微卫星的特异特征,在标记发展和其他遗传应用中,这就使得它们能够成为一种非常有价值的资源。

基于表达序列标签的微卫星标记(EST-SSRs)研究进展

作为一种新型分子标记 ,EST SSR来自表达基因 ,因而除具备传统基因组来源的SSR标记所有优势外 ,可能与基因功能表达具有直接或间接关系 ,从而强化了SSR标记在遗传研究中的应用。本文综述了近几年来EST SSR用于遗传图谱构建、基因定位。

香蕉EST-SSRs标记的开发与应用

从NCBI搜索的2282条香蕉EST中，发掘出含有SSR的EST序列110条，共有122个SSR位点，检出率为5.3％。SSR位点可分为37种重复单元，平均长度为20bp，其中二、三核苷酸重复单元的SSR占主导地位，分别占总SSR的33．1％和47．6％。GA和GAA是二、三核苷酸中的优势重复类型，分别占二、三核苷酸重复类型的75．7％和36．0％；其他重复类型所占比例均不足10％，而四核苷酸重复类型最少，为4．0％。设计的63对EST-SSRs引物中，有41对EST-SSRs引物对巴西蕉基因组DNA能扩增出产物，占总引物数的65．1％。应用进一步筛选出的重复性好、多态性高的19对引物对49个香蕉品种（系）进行PCR扩增。每对51物扩增的多态性带数目为4～12个，平均7．58个；引物多态信息量变化范围为0．3572．0．8744，平均0．7324。在相似系数为0．63的水平可将49个品种聚为2个类群：一类为含B基因组香蕉品种；另一类为不合B基因组的香蕉品种，表明EST-SSR引物可以应用于香蕉品种资源分类的研究。

麦红吸浆虫唾腺EST-SSRs的信息分析及分子标记筛选

昆虫EST资源库的扩充为开发新的分子标记提供了宝贵的资源。本研究对NCBI的EST数据库中来源于麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana唾腺的1217条EST序列进行了unigene组装、SSR信息分析和EST-SSR分子标记筛选。结果表明:在1047个unigenes中共找到141个SSR位点,分布于106个(10.12%)unigenes中,平均每3.49kb出现一个SSR位点。在1～6碱基重复基元中,1～3碱基是主要重复类型,占总SSR的97.16%以上。A/T(31.21%),AC/GT(15.60%)和AAC/GTT(9.22%)分别是单、双和三碱基中占优势的重复基元类型。利用Primer Premier5.0软件对查找的EST-SSRs进行引物设计,并以麦红吸浆虫基因组DNA为模板,对从中选出的26对SSR引物进行多态性检测。结果有20对(76.92%)引物能扩增出清晰的目的条带,并且其中9对(45%)引物表现出多态性。多态性分析结果表明,从9对EST-SSR引物中,共检测到51个等位基因,平均每个位点含有等位基因数为5.67,平均期望杂合度为0.65,平均多态信息含量为0.60。本研究能够为今后麦红吸浆虫的种群遗传结构与遗传多样性研究提供帮助。

黄瓜基因组EST-SSRs的分布规律及EST-SSR标记开发

从NCBI网站下载黄瓜EST序列6 344条及本课题组对黄瓜叶片cDNA文库测序研究所得的EST 163条,在除去载体、polyA/T等序列后得到6 129条无冗余EST序列,全长为2.98×106bp.采用网络软件SSRIT从这些序列中搜索到784个SSR,分布于673条EST中,出现频率为12.79%,平均分布距离为3.80 kb;单、二和三核苷酸重复是主导类型,分别占EST-SSRs总数的32.91%、28.19%和29.34%;A/T、AG/CT和AAG/CTT分别是单、二和三核苷酸的优势重复基元,分别占EST-SSRs总数的32.40%、20.66%和14.41%.经现已报道的评价方法分析表明,这些EST-SSRs具有较好的多态性和可用性.设计了30对EST-SSR引物对22份黄瓜材料进行PCR检测,18对引物检测到多态性.根据PCR结果,这些材料被聚为三类,聚类结果与材料本身特性一致.结果说明通过黄瓜EST数据库发掘SSR标记是一条可行的途径.

茶树EST-SSRs在山茶科植物中的通用性研究

[目的]研究茶树EST-SSRs在山茶科植物中的通用性。[方法]选用来源于茶树EST序列的7对EST-SSRs引物,对山茶科植物的19份材料进行了扩增。[结果]7对EST-SSRs引物中有5对引物能对19个供试材料进行有效扩增,通用性比率为71.43%;扩增率最高的为云南山茶凤山茶、华东山茶彩霞和云南山茶菊瓣,最低的为川滇莲蕊茶和大花杨桐;有效扩增的5对引物对中有4对引物在供试材料中表现出丰富且差异明显的多态性。[结论]从茶树基因组上开发的SSR引物在山茶科植物不同种属植物间有较高的通用性,可用于山茶科植物比较基因组研究和分析标记研究。

草鱼EST-SSRs标记的筛选及其与生长性状相关分析

利用草鱼(Ctenopharyngodon idella)EST(expressed sequence tags)数据库开发的18个EST-SSR标记,对草鱼群体进行基因型与生长性状关联分析和群体遗传多样性分析,结果表明:关联分析得到6个微卫星位点(13118、13305、24017、25085、35939和40698)与体重,体长和体高显著或极显著相关(P<0.05或P<0.01)。对其进行多重比较获得有利基因型分别为13118位点的BB、13305位点的AD、24017位点的AC、25085位点的BE、35939位点的BB和40698位点的BB。将6个微卫星位点上的EST序列与GenBank数据库进行BLAST比对,其中24017序列与鲤鱼自然杀伤细胞增强因子(NCEF)同源性水平高达86%,25085序列与草鱼反应元件结合蛋白(CREB)的基因同源性水平达到80%。应用这18个微卫星位点对草鱼养殖群体进行遗传多样性分析,共检测到82个等位基因,平均等位基因4.556个,每个位点检测到的等位基因数为2～9个,群体的平均观测杂合度为0.452 9,平均期望杂合度和平均多态信息含量分别为0.457 1和0.401 7,表明该群体遗传多样性处于低水平。

辣椒EST-SSRs标记的通用性研究

为研究辣椒EST-SSRs标记在主要茄科蔬菜间的通用性,从NCBI数据库下载118 900条辣椒相关EST,对其进行SSR位点搜索,用含SSR位点的辣椒ESTs设计的200对EST-SSRs引物对17份辣椒材料、24份番茄材料、16份茄子材料进行PCR扩增,有效扩增比率分别为98%、94.5%、90.5%,多态性比率分别为35.5%、29.5%、26.5%。多态性引物对辣椒、番茄、茄子的特定亲本及其杂种一代F1的亲缘关系进行检测,均能达到预期效果,试验结果说明从辣椒相关EST数据库中开发的SSR引物在茄科植物中有较好的通用性。

EST-SSRs在小麦研究中的应用

小麦EST-SSR s是从小麦ESTs序列中开发的一种新型SSR标记。这种分子标记来源于表达基因,其多态性直接反映了基因的多样性,基于表达序列设计的小麦EST-SSR s引物具有很好的扩增效果,在小麦遗传分析中应用广泛。本文阐述了EST-SSR s的特点,介绍了小麦EST-SSR s的研究进展。

胡麻EST-SSRs标记分布特征及PCR反应体系的优化

从美国NCBI数据库中下载了286 868条亚麻EST,利用SSRIT软件检索出符合要求的SSR重复序列4 310条,占整个EST数据库的1.50%。其中三核苷酸出现频率最高,占总SSR的40.09%;SSR重复类型总共235种,序列中占总SSR比例大于1%的重复类型共有21种,占SSR序列总数的68.63%。通过正交设计(L_(16))得到了胡麻EST-SSR最佳PCR反应体系:即20μL反应体系里,引物0.2μmol/L、模板DNA 50 ng、d NTP 0.10 mmol/L、Mg^(2+)1.5 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.50 U/μl、2μL 10×buffer,其余用dd H_2O补齐。并通过单因素优化试验,对得到的胡麻EST-SSR最佳PCR反应体系进行了验证,结果完全一致。