EV-71型疫苗接种前后济宁市手足口病发病和病原学变化研究

目的了解济宁市2012—2021年肠道病毒71型(EV-71型)疫苗接种前后济宁市手足口病发病和病原学变化情况。方法采用描述性流行病学方法对济宁市手足口病发病和病原学情况进行分析,比较EV-71型疫苗接种前后手足口病发病和病原学变化。结果2012—2021年济宁市6月龄~5岁儿童中,手足口病发病率为658.93/10万,其中,2018年发病率最高(1094.63/10万),2021年发病率最低(247.23/10万)。实验室诊断病例中,EV-71型占27.89%,柯萨奇病毒A16型(CV-A16)占34.59%,非EV-71非CV-A16型占37.52%。6月龄~5岁儿童中,EV-71型估算发病率为131.04/10万,2017年估算发病率最高(322.13/10万),2021年最低(7.71/10万)。重症病例以EV-71型为主,占76.25%。2016—2021年济宁市EV-71疫苗平均估算接种率为7.98%。EV-71型疫苗接种后手足口病EV-71型占比低于接种前,下降4.80%。优势毒株为EV-71型的年份是2013年和2017年,2018年起EV-71型占比开始降低,2021年最低(5.16%)。结论济宁市EV-71型疫苗接种率比较低。接种EV-71型疫苗后,EV-71型估算发病率虽在2017年达到高峰,但之后呈下降趋势,毒株以CV-A16型和非EV-71非CV-A16型居多,应进一步开展非EV-71非CV-A16分型,研发多价手足口病疫苗。

EV-71感染手足口病患儿血神经元特异性烯醇化酶水平变化及其临床意义

目的观察EV-71感染对手足口病患儿血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平的影响,探讨其感染与神经系统损伤的相关性,为潜在神经系统损伤的早期干预及治疗提供理论依据。方法随机收集2011年4月至2012年11月间在本院儿内科治疗的100例手足口病患儿的临床资料,依据血清EV-71抗体检测结果分为阳性组43例和阴性组57例;同时选择在本院保健科进行体检的健康儿童80例作为对照组。应用电化学发光法进行血清NSE含量测定。对手足口病组和对照组、EV-71阳性组和阴性组血清NSE值进行对比分析。结果手足口病组和对照组比较,血清NSE水平偏高,差异有显著统计学意义(P<0.01);EV-71阳性组和阴性组患儿比较,血清NSE水平明显高于阴性组,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论手足口病患儿血清NSE水平较正常儿童有明显偏高,EV-71阳性患儿最为明显,提示手足口病患儿较正常儿童易并发神经系统损伤,EV-71感染的手足口病患儿神经系统损伤相对更为严重。

发热与手足口病(EV-71)合并病毒性脑炎相关性研究

目的:研究发热与手足口病(EV-71)合并病毒性脑炎相关性,为临床早期诊断重型手足口病提供指导。方法:回顾研究某院手足口病住院病人1097人,合并病毒性脑炎425例,符合入选条件374例,分析发热与病毒性脑炎相关性。结果:手足口病(EV-71)发热超过39℃2天以上和/或发热38.5℃超过3天以上,大多并发病毒性脑炎,对临床早期判断重型手足口病有指导意义,重型手足口病早期应用静注免疫球蛋白预后好。

蛴螬提取物体外抗肠道EV-71病毒的研究

目的:对蛴螬用不同极性的溶剂提取并研究其提取物对肠道EV-71病毒的抑毒效果,对其有效部位进一步分离。方法:分别用蒸馏水、75%乙醇、乙酸乙酯提取蛴螬,对其水提醇沉和醇提水沉的上清液和沉淀分别进行对肠道EV-71病毒的抑毒实验,根据实验结果对水提醇沉的沉淀部位通过大孔树脂吸附的方法进一步分离。结果:蛴螬水提醇沉的沉淀物对肠道EV-71病毒有明显的抑制作用,其TI=94.15;对其用大孔树脂吸附的方法分离后水1部位抗病毒效果最为明显,TI=118.93。结论:蛴螬的水提醇沉的沉淀部位具有良好的抗肠道EV-71病毒效果。

检测EV71和EV-U的TaqMan-LNA探针多重荧光RT-PCR的建立

目的建立一种针对手足口病病原体的快速准确检测方法。方法利用TaqMan-LNA探针建立多重荧光定量RT-PCR方法,同时检测肠道病毒71型(EV71)和肠道病毒通用型(EV-U),用含有目的序列RNA的标准品制备标准曲线,对病毒进行准确定量,同时对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评估。结果用TaqMan-LNA探针多重荧光RT-PCR法检测CoxA16、CoxB2、EV71病毒和其他人类病毒RNA,证实其特异性为100%;对EV71和EV-U的检测灵敏度均达到102拷贝/μl;将EV71和EV-U的RNA标准品进行重复性实验,其批内、批间变异系数分别为0.97%～2.02%和0.89%～2.13%。结论本方法灵敏度较高,特异性强,重复性好,适用于手足口病的临床检测。

EV-71感染危重型手足口病危险因素分析

目的探讨EV-71感染的普通型手足口病(HFMD)进展为危重型的影响因素,建立危重型HFMD的早期预警模型。方法选择2016年杭州市某儿童医院收治的65例确诊为EV-71感染的手足口病患儿为研究对象,其中普通型30例,危重型35例。比较两组患儿的一般情况、现病史和实验室检查指标,采用单因素分析筛选风险因素,Logistic回归分析独立危险因素。建立早期预警模型,并采用受试者工作曲线(ROC)评价。结果EV-71感染的普通型HFMD与危重病例在口腔疱疹、发热天数、最高体温、高热天数、发病至初诊时间、发病至入院时间、血糖、血清IgG水平存在明显差异(P<0.05),Logistic模型显示血糖、最高体温、高热天数、发病至初诊时间和口腔疱疹是危重型手足口病的独立危险因素(P<0.05)。预测模型ROC曲线下面积(AUC)为0.915,模型的敏感度为89.2%,特异度为90.5%,总体准确率为89.7%。结论密切观察EV-71感染的普通型HFMD患儿的血糖、最高体温、高热天数、发病至初诊时间和口腔疱疹,能够对危重症倾向进行早期预警。

EV71型手足口病并发脑炎重症病例临床分析

目的研究肠道病毒71型(EV71)导致的手足口病并发脑炎重症病例的临床和实验室特点,以提高临床诊治水平。方法对笔者医院2011年5月～2012年1月收治的164例咽拭子EV71核酸检测阳性的手足口病并发脑炎重症患儿临床资料进行回顾性分析,将其分为重型组和危重型组,包括临床特征、实验室检查和治疗、转归情况。结果 164例患儿均有发热和皮疹。与重型组比较,危重型组中肌无力、抽搐、躁动症状的发生率较高,WBC、心肌受损相关指标(CK、CKMB、LDH、HBDH)、血糖及PCO2水平也明显升高。治疗上应积极采用甘露醇降颅内压(93.3%),酌情联合糖皮质激素(63.4%)及丙种球蛋白(15.9%)治疗,此外笔者医院重症病例通常加用鼠神经生长因子(72.6%)营养神经,匹多莫德(71.3%)提高免疫力。164例重症患儿中治愈好转158例,因病情危重自动出院1例,死亡5例。结论 EV71型HFMD并发脑炎重症患儿病情凶险,病死率高,需早期诊断、早期干预及细心护理,以提高治愈率,降低病死率。

31例确诊EV71感染所致重型手足口病诊治体会

目的:探讨肠道病毒71型(EV71)感染所致重型手足口病的临床特点和治疗方法。方法:采用描述性流行病学方法对31例确诊EV71感染所致重型手足口病患儿的临床资料进行回顾性分析。结果:男19例,女12例,年龄1岁～6岁8个月,患儿主要表现为持续高热、精神差、易惊、肢体抖动、呕吐;外周血WBC升高为主(67.8%);采用以糖皮质激素加静脉丙种球蛋白为主的综合治疗,31例患儿均治愈。结论:早期识别重型手足口病,采用以激素加丙球为主的综合治疗,能够取得满意的疗效。

人源抗EV71病毒中和表位SP70的Fab抗体研制

目的构建人源抗EV71病毒Fab噬菌体抗体库,筛选具有中和活性的人源单克隆抗体,为EV71感染引起的手足口病临床诊断及治疗奠定基础。方法从成人志愿者抗凝血中分离外周淋巴细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA。以cDNA为模板,用人源IgG Fab段基因引物扩增轻链及重链Fd区基因,分步克隆至pComb3载体,构建Fab噬菌体抗体库。以SP70为抗原对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,将获得的重组噬菌体感染XL1-Blue菌并诱导表达,用SP70对诱导表达的菌上清进行筛选。结果共获得3株轻、重链基因组合序列不同的克隆,且这3株Fab抗体可特异性结合SP70多肽。结论成功构建人源抗EV71病毒Fab噬菌体抗体库,并从中筛选出3株针对EV71病毒结构蛋白VP1上中和线性表位SP70的特异性人源Fab抗体,为研发新的手足口病诊断和治疗工具奠定基础。

小儿重症EV71型手足口病流行现状、病情特点及危险因素分析

目的小儿重症人肠道病毒71型(EV71)型手足口病(HFMD)流行现状、病情特点及危险因素分析。方法选择2017年2月-2019年2月本院收治的重症EV71型HFMD患儿103例作为研究对象,统计所有患儿的性别、年龄、症状、体征、实验室检查指标等临床资料,同时统计继发感染部位、病原菌类型等资料,并采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定患儿合并病毒感染种类,并多因素logistics回归分析重症EV71型HFMD发病的危险因素。结果EV71型HFMD患儿以EV71单一感染为主,所占比为53.40%,可合并CA16和EV混合感染;继发细菌感染以革兰阴性菌感染为主,所占比73.17%,其中以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主,所占比分别为24.39%和18.29%,继发细菌感染分布部位以下呼吸道为主,所占比分别为27.49%;发病时间主要集中在6~8月夏季,所占比为49.51%;发病年龄主要集中在0~3岁,所占比为66.02%;患儿临床表现以发热、皮疹、神经系统症状、呼吸系统症状、循环系统症状、颅脑MRI异常等为主,同时男童、年龄<3岁、住宿环境卫生差、个人卫生习惯差及疾病知识掌握度差等是均是发病危险因素(P<0.05)。结论重症HFMD患儿多以EV71单一及其混合病毒感染所致,且好发于夏季,患儿以高热、皮疹、中枢神经系统损害、呼吸循环系统损害主要临床表现,并可继发下呼吸道等部位细菌感染,以革兰阴性菌为主,同时年龄<3岁男童、住宿环境和卫生习惯差等因素均可增加其发病风险。

2010-2017年天津市滨海新区健康人群人肠道病毒71型血清中和抗体动态变化研究

目的:了解天津市滨海新区健康人群人肠道病毒71型(EV-A71)中和抗体动态变化,为手足口病防控方案提供依据。方法:采集2010-2017年天津市滨海新区健康人的血清学标本368份,进行EV-A71中和抗体测定,并对监测结果进行统计学分析。结果:EV-A71中和抗体阳性率为79.35%;不同年份间的抗体阳性率差异有统计学意义(χ^2=6.695,P=0.01),呈周期性变化;不同年龄组人群的抗体阳性率差异有统计学意义(χ^2=46.531,P<0.01),5岁及以下年龄组抗体阳性率最低为59.26%;5岁以下各年龄组抗体阳性率无统计学差异(χ^2=1.481,P=0.830);不同性别间抗体阳性率差异无统计学意义(χ^2=3.480,P=0.062);以健康人群EV-A71中和抗体阳性率作为应变量,对健康人群的卫生习惯及环境进行Logistic回归分析,发现与没去过医院的相比,半年内去过医院患病风险更大(OR=2.291,95%CI:1.488~4.946)。结论:天津市滨海新区人群EV-A71中和抗体水平较高,易感人群为5岁及以下年龄组儿童,继续加强和完善EV-A71流行监测系统是防控手足口病的重要环节。

肠道病毒71型分子生物学研究

就有关EV71病毒生物学特征、病毒的复制、诊断技术、EV型别鉴定及分子流行病学等方面作一综述。

肠道病毒71型VP1酶标抗原的制备及应用

为了建立用于肠道病毒71型(EV71)感染早期诊断的检测方法,将重组质粒pET-32a(+)-VP1转入大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达,对表达产物进行镍柱亲和层析纯化和复性,并对复性的VP1蛋白进行辣根过氧化物酶标记,作为酶标抗原建立捕获ELISA检测方法。结果表明,该方法μ链抗体包被浓度为1∶3 000,酶标抗原工作浓度为1∶20 000,且酶标抗原稳定性良好;检测临床血清样品阳性符合率为96.1%(49/51),阴性符合率为100%(65/65)。

肠道病毒A组71型在人脐静脉血管内皮细胞中的增殖及对细胞骨架的影响

目的研究肠道病毒A组71型(Enterovirus group A type 71,EV-A71)在人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中的增殖及对细胞骨架造成的影响,初步探讨其与病毒血症发生的关系。方法采用qRT-PCR技术及免疫荧光技术检测EV-A71在HUVECs中的复制和增殖,用免疫荧光双染色技术观察三种细胞骨架在EV-A71感染后的变化。结果 EV-A71能够有效感染HUVECs,且感染后24 h在细胞内复制达到高峰。病毒感染后微丝骨架完全解聚,微管骨架排列方式发生改变,而中间纤维结构模糊不清;同时检测到微管及中间纤维与病毒抗原共存。结论 EV-A71可以感染HUVECs并在其内有效复制增殖,同时诱导HUVECs三种细胞骨架发生改变,提示细胞骨架可能参与EV-A71感染HUVECs的过程。

北京市某区EV 71疫苗预防效果及第2剂疫苗完成情况影响因素分析

目的分析北京市某区EV 71疫苗对6月龄~4岁儿童手足口病的预防效果,探讨6月龄~5岁儿童EV 71疫苗第2剂次完成情况和影响因素。方法在北京市预防接种管理系统中选取2017年1月1日至2019年12月31日期间在北京市某区各预防接种门诊接种了EV 71疫苗的6月龄~4岁儿童,对照组选择北京市预防接种管理系统中对应2019年12月31日年龄满6月龄~4岁的某区在管儿童,调查2020年1月1日至2022年12月31日儿童手足口病报告发病情况,探讨EV 71对手足口病的预防效果。查询2016—2022年北京市某区6月龄~5岁儿童的EV71疫苗接种信息,对受种者基本信息、门诊设置、疫苗AEFI监测资料进行整理,分析儿童EV 71疫苗第2剂次完成情况和影响因素。结果EV 71疫苗的2剂次疫苗保护率为65.65%,2剂次疫苗组手足口病报告发病率(0.47%)低于1剂次疫苗组(0.67%)(χ^(2)=3.96,P=0.047)。本市户籍、城区地区、接种疫苗种类为EV 71疫苗(Vero细胞)、所在接种门诊登记台≥4的人群第2剂接种率更高(OR=2.22,95%CI:2.09~2.36;OR=1.23,95%CI:1.00~1.50;OR=7.99,95%CI:6.75~9.45;OR=1.26,95%CI:1.16~1.37)。结论提高第2剂疫苗接种率对于手足口病的预防有积极作用;EV 71疫苗的第2剂完成率受儿童户籍、地区、年龄、AEFI、疫苗种类和门诊配置等多方面影响,因此接种服务应有侧重,以提高EV 71疫苗第2剂完成率。

EV71、CA16和肠道病毒通用型三重荧光RT-PCR检测技术的建立

目的建立-种可以同时检测EV71、CA16和肠道病毒通用型的三重荧光RT-PCR检测方法,为手足口病监测与应急诊断提供高通量快速检测技术.方法分别在VP1和5’ UTR基因保守区设计EV71、CA16和肠道病毒通用型的特异性检测引物以及Taqman探针,建立并评估三重荧光RT-PCR技术的特异性和敏感性,并对91份疑似手足口病患儿临床标本进行核酸检测与效果验证.结果建立的三重荧光RT-PCR技术可同时对EV71、CA16和肠道病毒通用型进行特异性检测区分,敏感性均可达到0.1TCID50/mL,从核酸提取至完成检测仅需2～3h.91份疑似手足口病患儿临床标本采用三重荧光RT-PCR方法检测,EV71、CA16和其他型别肠道病毒的检出率分别为30.77%、9.89%和5.49%;荧光RT-PCR方法的检出率高于培养分离法.结论建立的三重荧光RT-PCR技术能同时准确分型EV71、CA16和其他型别肠道病毒.

肠道病毒71型(EV-A71)感染ICR小鼠模型的建立

为研究肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV-A71)经不同攻毒方式感染不同日龄ICR乳鼠的感染情况,了解EV-A71在小鼠体内的动态分布和感染机制,为建立EV-A71感染动物模型,本研究采用分离自重症手足口患儿的EV-A71毒株,分别通过肌肉注射(Intramuscular injection,IM)、腹腔注射(Intraperitoneal injection,IP)以及脑内注射(Intracerebral injection,IC)的方式感染3日、5日和9日龄ICR乳鼠,感染后定期采集血液和各组织,通过Realtime PCR追踪各组织中病毒载量变化,并且通过切片制作和免疫组化对感染乳鼠进行病原学和病理学分析。结果显示:对于低日龄(≤5日龄)乳鼠,注射剂量在104.5 TCID50/g·体重时IM、IP及IC均为较好的感染方式,都会出现神经症状,且有极高的致死率。随着日龄增长,感染后症状有所减轻,但IM和IP感染途径对大日龄乳鼠仍具有良好的致病性,且IM和IP死亡率显著高于IC死亡率。经IM、IP和IC注射感染病毒的3日龄乳鼠在6dpi体重相对于各对照组分别下降了1.54g(31.43%)、1.31g(15.06%)和2.52g(44.28%),而经IM和IP感染的5日龄乳鼠6dpi体重相对于各对照组分别下降了0.605g(8.95%)、0.886g(15.51%),经IC感染的5日龄乳鼠6dpi体重相对于对照组上升了0.904g(14.70%),感染组体重均显著低于对应的同期对照组(P<0.05)。经IM、IP和IC感染病毒的3日龄乳鼠9dpi均死亡,而5日龄乳鼠9dpi存活率分别为42.8%、25%和87.5,14dpi存活率分别为0%、0%和25%,9日龄乳鼠9dpi存活率分别为70%、84.62%和100%。病理学及免疫组化检查显示EV-A71病毒具有强烈的嗜神经性及嗜骨骼肌的特性,可导致病毒血症、脑神经元及骨骼肌坏死、心肌间质水肿及多脏器炎症反应。我们系统地研究了不同攻毒方式感染不同日龄的ICR乳鼠后的病毒动态分布及免疫病理损伤,发现经肌肉注射或腹腔注射5日龄乳鼠能够建立理想的EV-A71感染动物模型。

我国EV-A71疫苗研发特点和挑战

自2008年我国手足口病（HFMD）大流行后,HFMD已成为我国严重的公共卫生问题之一。由于严重的疾病负担,疫苗成为控制疾病的急需品种,国家在重大新药创制及科技支撑计划中均列出专项予以研究支持。2015年12月3日,历经7年的研发工作后,中国国家食品药品监督管理局（CFDA）批准中国医学科学院医学生物学研究所（简称：昆明所）研制的肠道病毒71型（EV-A71）全病毒灭活疫苗（人二倍体细胞）上市[1]。

CV-A16和EV-A71感染对肠道上皮细胞间连接分子排布和表达的影响

柯萨奇病毒A组16型(Coxsakievirus A 16,CV-A16)与肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV-A71)是引发手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)的两种主要病原体,然而两者的致病机理仍未完全被阐明。病毒感染对肠道上皮细胞间连接分子排布和表达直接与病毒感染造成的后果相关。本研究通过右旋糖苷穿透实验、免疫荧光以及蛋白免疫印迹等技术检测了CV-A16和EV-A71感染对肠道上皮细胞系(Intestinal epithelial cell)FHC后细胞通透性的变化以及细胞间连接分子排布和表达情况。研究结果表明,CV-A16和EV-A71感染FHC可导致其通透性显著增强、连接分子Nectin1、Claudin4、Claudin5、ZO-1以及E-Cadherin的排布被破坏,且表达量显著性降低。这一结果提示了CV-A16和EV-A71感染肠道FHC细胞并在细胞中复制引起肠道上皮细胞损伤,导致肠道上皮细胞间连接分子排布的改变和表达量的减少。

连云港市EV 71疫苗接种前后手足口病流行特征分析

目的了解连云港市EV 71型灭活疫苗接种前后手足口病的流行特征,为手足口病的科学防控提供依据。方法对2010—2021年连云港市报告的手足口病病例、病原学监测结果及2017—2021年EV 71疫苗接种情况进行统计,利用SPSS 25.0软件进行统计学差异检验和趋势分析,率的比较采用χ^(2)检验,检验水准为α=0.05。结果2010—2021年连云港累计报告手足口病60042例,年发病率在43.59/10万~206.65/10万之间;2017—2021年连云港市目标人群EV 71疫苗估算接种率和全程接种率逐年提升;疫苗接种前手足口病发病呈现隔年高发的趋势,接种后发病率持续下降;发病季节呈现双峰模式;病例集中在0~5岁(95.31%)的散居儿童和幼托儿童,报告发病率男性高于女性,市区高于市县;疫苗接种前病原以EV 71型肠道病毒为主,疫苗接种后,手足口病发病率、重症率、病死率、EV 71型肠道病毒构成比均显著下降。结论EV 71疫苗接种前后,连云港市手足口病的流行特征发生了明显的改变。在今后的防控工作中,建议进一步提高EV 71疫苗接种率,尤其是0岁组儿童和农村地区儿童的接种率,同时加强病原监测并开展有针对性的防控措施。