改良Trizol-SiO2法在咽拭子及疱疹液EV71-RNA提取中的应用

目的 研究改良Trizol-SiO2法在咽拭子及疱疹液EV71-RNA提取中相对于目前常用的Trizol-氯仿-二氧化硅提取法的优势.方法 选取2010年6月-2013年1月传染科及发热门诊300例手足口病患儿咽拭子和（或）疱疹液拭子标本分别采用Trizol-氯仿-二氧化硅提取法和改良Trizol-SiO2法进行实验结果统计学分析.结果 采用Trizol-氯仿-二氧化硅提取法的232例EV71-RNA阳性标本,采用改良Trizol-SiO2法所获得的定性结果均为阳性;采用Trizol-氯仿-二氧化硅提取法的68例EV71-RNA阴性标本,采用改良Trizol-SiO2法所获得的定性结果均为阴性,两种方法差异无统计学意义（P=0.993）.同时所获的EV71-RNA在进行荧光定量PCR扩增后的扩增曲线Ct值,两种方法差异无统计学意义（P=0.874）.结论 与目前实验室常用的提取EV71-RNA Trizol-氯仿-二氧化硅法相比较,改良Trizol-SiO2法剔除了氯仿试剂并延长了SiO2吸附核酸物质的时间,此方法实现了EV71-RNA的快速提取,适用于大样本量的操作,具有很好的临床应用价值.

RNA编辑酶ADAR1对EV71感染及变异的影响

目的研究RNA编辑酶腺苷酸脱氨酶(adenosine deaminase acting on RNA,ADAR1)对新型肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染及变异的影响。方法运用RNAi技术筛选ADAR1基因沉默稳定细胞株,通过MTT分析病毒感染后细胞活力变化、噬斑形成分析病毒滴度及细胞对病毒的敏感性,以及Western blot测定病毒蛋白表达水平等,分析ADAR1对EV71感染的影响。由于ADAR1介导的RNA编辑可使基因形成A-G或T-C突变,为确定ADAR1影响EV71感染是否与其编辑EV71基因组导致病毒变异有关,对EV71流行区EV71的突变特征进行分析;并利用EV71感染ADAR1基因沉默细胞,通过对病毒基因组测序分析,研究ADAR1是否直接编辑EV71基因组。结果 ADAR1基因沉默后,与对照细胞相比,病毒感染细胞的存活率下降更快,并形成更多、更大的噬斑。病毒感染细胞中的VP1蛋白和细胞培养基上清中的病毒滴度均明显增加。EV71突变特征分析表明,虽然A-G和T-C之间的变异是病毒突变的主要类型,但EV71感染实验初步证明,ADAR1并不直接编辑EV71病毒基因组。结论 ADAR1可能具有抗EV71感染的作用,但ADAR1可能并不直接编辑EV71基因组。

肠病毒EV71-IgM抗体与核酸检测在手足口病诊断中的价值

目的对2010年本院手足口病病例进行EV71核酸与EV71-IgM抗体检测,比较两方法的阳性符合率,评价抗体与核酸检测的临床诊断价值和两检测方法在诊断手足口病的互补性与意义。方法分别用RT-PCR方法与酶联免疫方法检测EV71-RNA和EV71-IgM抗体,选取其中住院60例核酸阳性并已同时进行血清学抗体检测的患者进行研究,结合病历资料,分析临床症状出现与抗体产生的时间关系。结果对临床320例病例分别进行抗体与核酸检测,两方法的阳性率分别为15.8%和32.9%;60例核酸阳性的患者,有49例检出抗体阳性,两种方法的阳性符合率是81.7%(49/60);此49例患者临床症状均较轻,多在出现低热、部分皮疹后2～3d才入院;而核酸阳性抗体阴性的11例病例,均为出现手、足、口、臀皮疹12h～1d入院的患者,多以高热病重急诊入院,此时抗体尚未产生,入院后2～3d均进行了抗体检测为阳性。结论核酸与抗体检测在EV71型手足口病中有重要临床诊断价值,两种方法同时检测具有较好的互补效果。对未能开展核酸检测的基层医院,可选用血清学方法检测抗体,对诊断和防控EV71型肠病毒感染引起的手足口病有重要意义。

RNAi技术对人脑微血管内皮细胞ANXA2基因表达水平的影响

目的研究RNAi技术对人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular cells,HBMEC)ANXA2基因表达水平的影响。方法将化学合成三对siRNA采用ribo FECT^(TM)CP转染试剂介导法转染HBMEC,应用荧光定量PCR法检测RNA干扰后ANXA2 mRNA表达量,得出抑制率。应用Western-blot检测RNA干扰后对ANXA2蛋白表达的影响。结果成功将siRNA转染HBMEC,荧光定量PCR结果显示,在转染24 h后,各干扰组与阴性组比较ANXA2基因表达量明显下调(P<0.01),Western-blot显示siRNA-ANXA2-2、siRNA-ANXA2-3转染前后ANXA2蛋白的表达水平明显受到抑制。结论合成的ANXA2 siRNA能有效抑制ANXA2蛋白的表达、降低ANXA2 mRNA水平,对ANXA2有高效和特异的沉默作用,以ANXA2为靶点的RNA干扰技术可望成为鉴定HBMEC有关EV71膜受体的新策略。

miRNA在肠道病毒71型手足口病诊断及治疗中的应用

自2008年以来,手足口病(HFMD)疫情在我国多个地区流行,给我国公共卫生局面带来巨大挑战,而肠道病毒71型(EV71)是引起手足口病的主要病原体之一。微小RNA(micro RNA)作为一种非编码单链RNA分子,通过调节病毒复制和基因表达在多种病毒感染性疾病的发生、发展和预后中发挥重要作用。本文就mi RNA分子在EV71型HFMD诊断、治疗中的作用和研究进展作以综述。