车叶草苷对少弱精症大鼠抗氧化应激及抗细胞凋亡的作用机制研究

目的:探讨车叶草苷(ASP)对少弱精症大鼠抗氧化应激及抗细胞凋亡的作用机制。方法:通过灌胃奥硝唑建立少弱精症大鼠模型,将SD大鼠按照随机数字表法分为对照组、模型组、车叶草苷组(60 mg/kg)和通路抑制剂(第3周腹腔注射2 mg/kg)+车叶草苷组,每组10只。检测大鼠精子参数;酶联免疫吸附试验法检测血清丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平;实时萤光定量聚合酶链式反应法检测睾丸组织B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(Bax)和核因子E2相关因子2(Nrf2)基因水平;蛋白质免疫印迹法检测睾丸组织Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)、Nrf2和血红素加氧酶1(HO-1)水平。结果:与对照组比较,模型组精子活力、精子浓度、GSH-Px、GSH、SOD、Bcl-2、Keap1、Nrf2、HO-1水平下降(P<0.05),MDA和Bax水平上升(P<0.05);与模型组比较,车叶草苷组精子活力、精子浓度、GSH-Px、GSH、SOD、Bcl-2、Keap1、Nrf2、HO-1水平上升(P<0.05),MDA和Bax水平下降(P<0.05)。结论:ASP能有效改善少弱精症大鼠精子活力、精子浓度,减少睾丸组织细胞的凋亡,改善氧化应激损伤,Keap1/Nrf2信号通路的激活可能是其作用机制。

血清Nrf2、Keap1水平变化与糖尿病视网膜病变分期间关系

目的探讨血清单核细胞核因子E2相关因子(Nrf2)、Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)水平变化与糖尿病视网膜病变(DR)分期间关系。方法选取2020年4月—2023年2月如皋市中医院DR患者147例作为观察组,并根据DR分期分为非增生型糖尿病视网膜病变(NPDR)、增生型糖尿病视网膜病变(PDR);另选取同期糖尿病无视网膜病变患者49例作为对照Ⅰ组,健康体检者49例作为对照Ⅱ组。对比3组及观察组不同DR分期患者血清Nrf2、Keap1水平,Spearman秩相关系数分析血清Nrf2、Keap1水平与DR分期间关系;多因素logistic回归分析血清Nrf2、Keap1水平对DR分期的影响;限制性立方样条图分析血清Nrf2、Keap1水平与DR分期的剂量-效应关系。结果观察组血清Nrf2水平低于对照Ⅰ组、对照Ⅱ组,Keap1水平高于对照Ⅰ组、对照Ⅱ组,对照Ⅰ组血清Nrf2水平低于对照Ⅱ组,Keap1水平高于对照Ⅱ组(P<0.05);随DR分期增加,血清Nrf2水平呈降低趋势,血清Keap1水平呈升高趋势(P<0.05);血清Nrf2水平与DR分期呈负相关(r=-0.806,P<0.001),血清Keap1水平与DR分期呈正相关(r=0.854,P<0.001);经多因素logistic回归分析,高血压、糖尿病发病年龄、总胆固醇对DR分期无显著影响(P>0.05),血清Nrf2水平是DR分期的独立保护因素,高脂血症、糖尿病病程、空腹血糖、糖化血红蛋白、血清Keap1水平是DR分期的独立危险因素(P<0.05);限制性立方样条图分析显示,血清Nrf2(χ^(2)=11.800,P<0.001)、Keap1(χ^(2)=8.401,P=0.015)水平与DR分期间存在非线性关系,控制其他病变为固定变量,血清Nrf2水平<1.70μg/L、血清Keap1水平>3.00μg/L时,PDR风险显著增加。结论血清Nrf2、Keap1水平变化与DR分期关系密切,血清Nrf2水平<1.70μg/L、血清Keap1水平>3.00μg/L时提示DR进展至PDR的风险显著增加。

苦参总黄酮对醋酸铅诱导小鼠睾丸间质细胞氧化应激的改善作用及对Keap1/Nrf2信号通路的影响

目的:观察苦参总黄酮(SF)对醋酸铅(LA)诱导的小鼠睾丸间质细胞TM3氧化应激的改善作用及其对KELCH状ECH相关蛋白1(Keap1)/细胞中核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路的影响,探讨SF改善由LA诱导的TM3细胞氧化应激的相关作用机制。方法:利用噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度(0、10、20、50和80µmol·L^(-1))LA和不同浓度(0、12.5、25.0、50.0和80.0 mg·L^(-1))SF分别干预24 h后的TM3细胞存活率;将TM3细胞随机分为空白对照组、LA组、LA+低剂量SF组、LA+中剂量SF组和LA+高剂量SF组。除空白对照组外,其他各组均采用50µmol·L^(-1)LA诱导TM3细胞24 h建立TM3细胞氧化应激模型,其中LA+低剂量SF组、LA+中剂量SF组和LA+高剂量SF组TM3细胞再分别给予12.5、25.0和50.0 mg·L^(-1)SF。利用MTT法检测TM3细胞存活率;WST-1法和硫代巴比妥酸(TBA)法检测TM3细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平;Western blotting法检测Nrf2、Keap1和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Caspase-9)蛋白表达水平。结果:MTT法检测,与0µmol·L^(-1)LA组比较,10、20、50和80µmol·L^(-1)LA组TM3细胞存活率明显降低(P<0.01);与0 mg·L^(-1)SF组比较,12.5、25.0、50.0和80.0 mg·L^(-1)SF组TM3细胞存活率明显降低(P<0.05或P<0.01);与LA组比较,LA+低剂量SF组、LA+中剂量SF组和LA+高剂量SF组TM3细胞存活率明显升高(P<0.01);WST-1法和TBA法检测,与LA组比较,LA+低剂量SF组、LA+中剂量SF组和LA+高剂量SF组TM3细胞中SOD活性明显升高(P<0.01),MDA水平明显降低(P<0.01);Western blotting法检测,与LA组比较,LA+低剂量SF组、LA+中剂量SF组和LA+高剂量SF组TM3细胞中Nrf2蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Keap1和Caspase-9蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:SF对LA诱导TM3细胞氧化应激具有一定改善作用,并可降低TM3细胞中Keap1蛋白表达水平,升高TM3细胞中Nrf2蛋白表达水平。

胺碘酮通过激活Keap1/Nrf2通路减轻大鼠心脏缺血再灌注损伤

目的探讨胺碘酮对心肌缺血大鼠的治疗作用及机制。方法SD大鼠被随机分为对照组、缺血再灌注(ischemia-reperfusion,IR)组、胺碘酮+IR组,每组8只,采用左冠状动脉前降支夹闭构建心肌IR损伤模型。TTC染色检测梗死心肌面积、苏木素伊红(hematoxylin eosin,HE)染色检测心肌组织病理变化;测定大鼠心脏功能;测定大鼠血清心肌损伤标志物[肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehy⁃drogenase,LDH)、肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ,cTnI)]及氧化应激指标[丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)];蛋白免疫印迹(Western blot,WB)测定Kelch样ECH关联蛋白1(Kelch like ECH associated protein 1,Keap1)、核因子E2相关因子2(nuclear factor ery⁃throid 2-related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、SOD、醌氧化还原酶[NAD(P)H:quinine oxidoreductase 1,NQO1]的蛋白表达浓度;实时聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)测定HO-1、SOD、NQO1的mRNA表达水平。结果与对照组比较,IR组大鼠心肌出现明显梗死、心肌组织呈明显病理损伤,胺碘酮+IR组心肌梗死面积明显减少、心肌损伤明显改善;胺碘酮+IR组大鼠心功能、血清CK-MB、LDH、cTnI浓度明显低于IR组,差异有统计学意义(P<0.05);胺碘酮+IR组大鼠心肌细胞活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)、血清MDA浓度明显低于IR组,而血清GSH、SOD浓度明显高于IR组,差异均有统计学意义(P<0.05);与IR组相比较,胺碘酮+IR组大鼠Nrf2明显升高、Keap1明显下降;胺碘酮+IR组大鼠HO-1、SOD2、NQO1的mRNA、蛋白表达均明显高于IR组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论胺碘酮对心肌IR损伤大鼠具有保护作用,其机制可能与激活Keap1/Nrf2通路抑制氧化应激反应相关。

嗅三针对血管性痴呆大鼠海马CA1区损伤及Keap1/Nrf2/ARE信号通路关键蛋白的影响

目的:观察嗅三针对血管性痴呆(VD)大鼠行为学、海马组织病理形态、Keap1/Nrf2/ARE信号通路关键蛋白的影响。方法:60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、嗅三针组、抑制剂组,每组15只。采用双侧颈总动脉结扎术建立VD模型。嗅三针给予带电干预。采用Morris水迷宫检测大鼠行为学变化,HE染色检测海马CA1区组织形态变化,免疫荧光法检测海马CA1区Nrf2蛋白表达情况,Western blotting检测HO-1、NQO1蛋白表达情况。结果:模型组、抑制剂组大鼠寻找目标平台游泳的距离明显大于假手术组、嗅三针组。空间探索试验结果中,假手术组、嗅三针组穿越平台区次数、平台区游泳距离明显多于模型组、抑制剂组。模型组病理形态中细胞排列紊乱,坏死数量多于假手术组。嗅三针组海马区病理形态的细胞形态清晰、排列整齐,优于模型组。抑制剂组海马区细胞排列不齐,数目少于嗅三针组;嗅三针组Nrf2蛋白表达高于模型组、抑制剂组。嗅三针组大鼠海马组织HO-1、NQO1表达高于模型组、抑制剂组,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论:嗅三针能够改善VD大鼠认知障碍,减少海马损伤,通过激活Nrf2,调节HO-1、NQO1蛋白表达,发挥对抗氧化应激作用。

葡萄籽原花青素提取物预灌胃对造影剂诱导糖尿病大鼠急性肾损伤的预防作用观察

目的观察葡萄籽原花青素提取物预灌胃对造影剂诱导糖尿病大鼠急性肾损伤的预防作用,并探讨可能作用机制。方法50只SD肥胖大鼠,腹腔注射1%链脲佐菌素(40 mg/kg),41只成功建成糖尿病大鼠模型,随机分为DM组8只、CM组9只、葡萄籽原花青素提取物低剂量组8只、中剂量组8只、高剂量组8只,另取10只肥胖大鼠为空白对照组(NC组),1 mL/kg腹腔注射柠檬酸缓冲液;低、中、高剂量组大鼠每日分别用50、250、500 mg/kg的葡萄籽原花青素提取物灌胃1次,连续3天,第3天灌胃24 h时尾静脉注射碘海醇(1.8 g I/kg);NC组、DM组、CM组大鼠每日用10 mL/kg生理盐水灌胃1次,第3天灌胃24 h时,NC组、DM组尾静脉注射5 ml/kg生理盐水;CM组尾静脉注射碘海醇(1.8 g I/kg)。末次给药48 h时各组大鼠断尾采血,检测血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN),采血后处死各组大鼠,取肾组织检测肾组织氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA),采用原位缺口末端标记法测算各组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数,采用Western Blotting法检测各组大鼠肾组织核因子E2相关因子2(Nrf2)-Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)通路相关醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素单加氧酶-1(HO-1)、Nrf2、Keap1蛋白。结果与NC组比较,CM组及低剂量组血清SCr、BUN水平高(P均<0.05)。与CM组比较,NC组、DM组、低中高剂量组血清SCr、BUN水平低(P均<0.05);与低剂量组比较,中、高剂量组大鼠血清SCr、BUN水平低(P均<0.05)。与NC组比较,DM组、CM组、低中剂量组肾组织匀浆SOD水平低,DM组、CM组及低剂量组肾组织匀浆MDA水平高(P均<0.05)。与CM组比较,DM组、低中高剂量组肾组织匀浆组SOD水平高、MDA水平低(P均<0.05)。与CM组比较,中、高剂量组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数小(P均<0.05)。与NC组比较,CM组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量低,中高剂量组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量高(P均<0.05);与CM组比较,低中高剂量组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量高(P均<0.05);与中剂量组比较,低剂量组大鼠肾组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白相对表达量低(P均<0.05)。结论葡萄籽原花青素提取物可改善尾静脉注射造影剂糖尿病大鼠的肾损伤程度,且500 mg/kg时效果最好。葡萄籽原花青素提取物可能通过激活Nrf2—Keap1信号通路,预防造影剂诱导的糖尿病大鼠的急性肾损伤。

Keap1/Nrf2/ARE信号通路调控脑出血后氧化应激的研究进展

脑出血是一种常见的、严重的脑卒中亚型,具有较高的发病率和死亡率,多数患者伴有不同程度的神经功能障碍,给全球带来了重大的健康和社会经济问题。脑出血急性期所诱发的氧化应激可引起机体发生氧化应激损伤,是引起继发性脑损伤的关键因素。研究表明,Keap1/Nrf2/ARE通路是最重要的抗氧化应激通路,该通路被激活后,可促进抗氧化应激酶的表达,从而减轻氧化应激损伤。现就Keap1/Nrf2/ARE通路改善脑出血后氧化应激损伤的研究进展进行综述,旨在为临床治疗脑出血患者提供新的治疗思路和客观依据。

基于Keap1/Nrf2信号通路探讨丹葛解酲汤对酒精性肝病大鼠模型的作用机制

目的 观察丹葛解酲汤对酒精性肝病(ALD)大鼠模型的治疗作用,探讨丹葛解酲汤抗氧化应激的作用机制。方法 将96只SD大鼠随机分为空白组(n=13)和ALD组(n=83),ALD组采用白酒灌胃法建立ALD模型。随后将存活ALD组大鼠随机分为模型组、丹葛解酲汤高剂量组(24 g/kg)、丹葛解酲汤低剂量组(6 g/kg)及益肝灵片组(21 mg/kg),每组各17只,空白组和模型组给予生理盐水灌胃,其余组分别灌胃给予相应的药物,共干预4周。采用HE染色法观察大鼠肝组织的病理变化;Western Blot法检测肝脏组织Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)、核转录因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶1(HO-1)的蛋白含量;实时荧光定量PCR检测肝组织Keap1、HO-1 mRNA表达水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 与空白组相比,模型组肝细胞排列紊乱,出现肝细胞坏死,有大量炎性细胞浸润,并伴有大量的脂滴空泡;Keap1蛋白、Keap1 mRNA表达水平均明显上升(P值均<0.05),Nrf2蛋白、HO-1蛋白、HO-1 mRNA表达水平均明显下降(P值均<0.05)。与模型组相比,丹葛解酲汤高剂量组、丹葛解酲汤低剂量组及益肝灵片组肝细胞排列变整齐,坏死及炎性细胞减少,偶见或无脂滴空泡;Keap1蛋白、Keap1 mRNA表达水平显著降低(P值均<0.05),Nrf2蛋白、HO-1蛋白、HO-1 mRNA表达水平显著上升(P值均<0.05)。结论 丹葛解酲汤可能通过调节Keap1/Nrf2信号通路,促使Nrf2入核,上调HO-1的表达,减轻氧化应激反应,进而对ALD大鼠发挥保护作用。

基于Keap1/Nrf2信号通路探讨葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜损伤机制

目的基于氧化应激信号通路探讨葛根芩连汤抗溃疡性结肠炎的作用机制。方法50只BALB/C雄性小鼠随机分为正常组、模型组、葛根芩连汤低、高剂量、柳氮磺吡啶组。除正常组外,其他各组自由饮用2.5%葡聚糖硫酸钠,连续7 d,造模成功后给予药物连续干预7 d。每天记录小鼠体质量、粪便等一般生理状态;比较结肠长度;苏木素-伊红(HE)染色观察结肠组织形态学变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α的含量。Western印迹检测结肠组织核因子-E2相关因子(Nrf)2、Kelch-样ECH相关蛋白(Keap)1、细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2蛋白表达水平。结果与模型组相比,葛根芩连汤各剂量组体质量下降趋势明显得到缓解,且腹泻、便血症状得到改善;血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量明显降低(P<0.01);HE染色发现结肠组织病理性损伤明显减轻;Western印迹结果显示,葛根芩连汤各剂量组结肠组织中Keap1蛋白表达量明显降低,Nrf2、p-ERK1/2蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论葛根芩连汤通过调节Keap1/Nrf2氧化应激信号通路而改善溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜损伤。

CircECH1通过充当miR-365-5p海绵抑制猪前体脂肪细胞增殖

环状RNA(circRNA)是一种共价封闭RNA,在脂肪发育过程中具有重要作用。本研究旨在探讨猪环状RNA ECH1(circECH1)对前体脂肪细胞增殖的调控机制。本研究通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析、Sanger测序和RNase R酶消化法成功鉴定circECH1的稳定环状结构,其在马身猪各个组织中均有表达,并且其在脂肪组织中的表达量随日龄增加呈上升趋势。功能研究证明,干扰circECH1后,增殖相关基因PCNA、CDK1和MKi67极显著升高(P<0.01),增殖细胞数量极显著增加(P<0.01)。为进一步探究其分子机制,使用miRDB、miRWalk和RNAhybrid预测circECH1的下游靶基因。通过双荧光素酶报告基因分析和RNA结合蛋白免疫沉淀技术,验证circECH1能靶向结合miR-365-5p。在猪前体脂肪细胞中过表达miR-365-5p会增殖相关基因PCNA和CDK1的表达量极显著升高(P<0.01),增殖细胞数量极显著增加(P<0.01);干扰miR-365-5p后增殖相关基因PCNA、CDK1和MKi67的表达量极显著降低(P<0.01),增殖细胞数量极显著增加(P<0.01)。挽救实验结果显示,共转染si-circECH1和miR-365-5p inhibitor与单独转染miR-365-5p inhibitor相比,增殖相关基因PCNA、CDK1和MKi67的表达量显著升高(P<0.01),增殖细胞数量显著升高。本研究结果证明,circECH1存在于马身猪的脂肪组织中,并且通过海绵吸附miR-365-5p调控猪前体脂肪细胞增殖,为进一步了解调控猪前体脂肪细胞的分子机制提供理论依据。

基于Nrf2/Keap1通路探讨柴贝止痫汤对海人酸致痫大鼠的神经保护作用机制

目的探讨柴贝止痫汤对海人酸致痫大鼠氧化应激反应及核因子E2相关因子2(Nrf2)/Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)信号通路的影响。方法雄性Wistar大鼠30只,随机取10只作为假手术组,余20只采用海人酸侧脑室注射方法建立慢性复发性癫痫模型。将造模成功的大鼠随机分为癫痫组及柴贝止痫汤组各8只,柴贝止痫汤组大鼠给予柴贝止痫汤8.48 g/kg灌胃,假手术组和癫痫组大鼠给予生理盐水灌胃,均1次/d,连续8周。采用Morris水迷宫行为学实验评估大鼠空间学习及记忆能力,试剂盒检测血清丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性,HE染色观察海马组织病理形态,Western blot法检测海马组织中Nrf2及Keap1蛋白表达情况。结果与假手术组比较,癫痫组大鼠定位航行实验逃避潜伏期明显延长(P<0.05);空间探索实验中总路程明显延长(P<0.05),平台区域路程及平台象限停留时间均明显缩短(P均<0.05),穿越平台次数明显减少(P<0.05);血清MDA含量明显升高(P<0.05),血清SOD及CAT活性均明显降低(P均<0.05);HE染色显示大鼠脑组织结构重度异常,海马CA1、CA3及DG区可见大量神经元变性,固缩深染,神经元纤维缠结;海马组织中Keap1蛋白表达量明显增加(P<0.05),Nrf2蛋白表达量明显降低(P<0.05)。与癫痫组比较,柴贝止痫汤组大鼠逃避潜伏期和总路程均明显缩短(P均<0.05),平台区域路程及平台象限停留时间均明显延长(P均<0.05),穿越平台次数明显增加(P<0.05);血清MDA含量明显降低(P<0.05),SOD及CAT活性均明显增高(P均<0.05);HE染色显示大鼠脑组织结构轻度异常,可见少量神经元变性,固缩深染,个别神经元纤维缠结现象;海马组织中Keap1蛋白表达量明显降低(P<0.05),Nrf2蛋白表达量明显增加(P<0.05)。结论柴贝止痫汤可改善海人酸致痫大鼠空间学习及记忆能力,保护神经元细胞,作用机制可能与激活Nrf2/Keap1信号通路,抑制氧化应激反应有关。

青藤碱激活Keap1/Nrf2信号通路抑制氧化应激和肺纤维化

目的:探讨青藤碱(SIN)对氧化应激损伤、肺纤维化的保护作用及与Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)/核因子E_(2)相关因子2(Nrf2)信号通路的关系。方法:通过过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导MRC-5细胞建立氧化应激损伤模型,并予SIN处理,采用CCK-8法检测细胞活力,生化试剂盒检测丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性,Western blot检测Keap1、Nrf2蛋白表达。将30只SD大鼠随机分为对照组、博莱霉素A5(BLM)组和BLM+SIN组,每组包含10只动物,BLM组、BLM+SIN组气管内注射BLM建立大鼠肺纤维化模型,对照组气管内注射等体积9 g/L氯化钠溶液,造模后次日,BLM+SIN组以SIN灌胃,其余两组给予9 g/L氯化钠溶液灌胃,第28天处死大鼠,分离肺组织,通过HE和Masson染色观察肺组织病理学改变,测定肺组织MDA含量及SOD、GSH-Px、CAT活性,Western blot检测Keap1、Nrf2蛋白表达。结果:相对于H_(2)O_(2)组,SIN干预后MRC-5细胞活力增加,MDA含量降低,SOD、GSH-Px和CAT活性升高,下调Keap1表达,促进Nrf2核移位。与BLM组相比,SIN给药降低大鼠肺泡炎、肺纤维化病变和评分及肺组织MDA含量,增加肺组织SOD、GSH-Px和CAT活性,下调肺组织Keap1表达,升高胞核Nrf2水平。结论:SIN可能通过激活Keap1/Nrf2信号通路抑制氧化应激损伤,减轻大鼠肺纤维化。

KEAP1-NRF2/HO-1通路介导LED红光促高糖诱导下人牙周膜干细胞成骨分化及减轻氧化损伤

目的探讨Kelch样ECH相关蛋白1-核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1(Kelch-like ECH associated protein 1-nuclear factor erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase-1,KEAP1-NRF2/HO-1)通路介导发光二极管(light-emitting diode,LED)红光对高糖诱导下人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)成骨分化和氧化损伤的影响,为LED红光在细胞抗氧化损伤中的应用提供依据。方法流式细胞术、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和茜素红染色鉴定hPDLSCs;高糖预处理hPDLSCs 48 h,用1、3、5 J/cm^(2)LED红光照射细胞,CCK-8实验选择促细胞增殖率高的辐射曝光量进行后续实验。将hPDLSCs分为对照组、高糖组、高糖+光照组;ALP染色、ALP活性检测、茜素红染色和半定量分析检测成骨分化能力,qRT-PCR和Western blot检测细胞成骨相关基因ALP、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX)基因和蛋白表达;qRT-PCR检测相关抗氧化酶基因超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)、过氧化氢酶(catalase,CAT)表达;荧光显微镜观察和流式细胞术测定细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平;ELISA检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)水平。以NRF2特异性抑制剂ML385抑制NRF2通路,ALP染色、ALP活性检测细胞早期成骨分化能力,q RT-PCR检测早期成骨分化标志物ALP、RUNX2、OSX基因表达,Western blot检测细胞KEAP1、NRF2、HO-1蛋白表达水平。结果选择促高糖诱导下hPDLSCs增殖率最高的5 J/cm^(2)辐射曝光量进行后续实验(P<0.05)。5 J/cm^(2)LED红光促进高糖诱导下hPDLSCs的成骨分化(P<0.05),上调ALP、RUNX2、OSX的基因与蛋白表达(P<0.05),上调SOD2、CAT基因表达(P<0.05),降低细胞ROS水平(P<0.05),减少细胞上清液中TNF-α、IL-1β水平(P<0.05)。ML385抑制NRF2通路,细胞ALP活性降低(P<0.05),ALP、RUNX2、OSX基因表达下降(P<0.05),KEAP1蛋白表达上升(P<0.05),NRF2、HO-1蛋白表达下降(P<0.05)。结论LED红光可能通过KEAP1-NRF2/HO-1通路促进高糖诱导下hPDLSCs增殖和成骨分化,减轻氧化损伤。

LncRNA LINC01503调控miR-331-3p/Nrf2/Keap1信号通路对缺氧诱导PC12细胞损伤的影响

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)LINC01503对缺氧诱导的PC12细胞增殖、凋亡、氧化应激的影响及其对miR-331-3p/核因子相关因子(Nrf)2/Kelch样ECH相关蛋白(Keap)1信号通路的调控作用。方法采用缺氧诱导PC12细胞建立细胞损伤模型,分别将si-NC、si-LINC01503、miR-NC、miR-331-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-331-3p、si-LINC01503与anti-miR-NC、si-LINC01503与anti-miR-331-3p转染至PC12细胞48 h后进行缺氧处理24 h;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测LINC01503、miR-331-3p的表达量;噻唑蓝(MTT)、流式细胞术分别检测细胞增殖、凋亡率;检测乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量;双荧光素酶报告实验检测LINC01503与miR-331-3p的靶向关系;Western印迹检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、裂解半胱天冬酶(Cleaved-caspase)-3、Nrf2、Keap1蛋白表达量。结果缺氧诱导的PC12细胞中LINC01503的表达水平明显升高,miR-331-3p表达、细胞活力及CyclinD1蛋白水平明显降低,凋亡率及Cleaved-caspase-3、Nrf2、Keap1蛋白水平、MDA、LDH的含量明显升高,而SOD的含量明显降低(均P<0.05);转染si-LINC01503或转染miR-331-3p mimics后可明显提高细胞活力、CyclinD1蛋白水平及SOD的含量(P<0.05),降低凋亡率、Cleaved-caspase-3、Nrf2、Keap1蛋白水平及MDA、LDH的含量(P<0.05);双荧光素酶报告实验证实LINC01503可充当miR-331-3p竞争性内源RNA;共转染si-LINC01503与anti-miR-331-3p可明显逆转抑制LINC01503表达对缺氧诱导的PC12细胞增殖、凋亡、氧化应激及Nrf2/Keap1信号通路的作用。结论抑制LINC01503表达可通过上调miR-331-3p的表达而促进细胞增殖及抑制氧化应激、凋亡从而减轻缺氧诱导的PC12细胞损伤,其作用机制可能与抑制Nrf2/Keap1信号通路的活化有关。

基于Keap1-Nrf2/HO-1信号通路探讨miR-141对大鼠脑缺血再灌注后的炎症反应及保护神经元功能的研究

目的探究miR-141靶向KELCH样ECH关联蛋白-核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1(Keap1-Nrf2/HO-1)信号通路调控脑缺血再灌注(IR)后的炎症反应及保护神经元功能的作用机制。方法60只大鼠随机分为sham组、IR组、agomirNC组、miR-141组;agomir-NC组、miR-141组大鼠侧脑室注射agomir NC、miR-141 agomir,sham组、IR组注射等体积生理盐水。用大脑中动脉栓塞(MCAO)构建IR模型,sham组只插线不结扎。72 h后行神经功能学评分;TTC染色、TUNEL染色检测脑梗死体积和细胞凋亡;ELISA法、qRT-PCR、Western blot检测IL-1β、IL-6、TNF-α、miR-141、Keap1、Nrf2、HO-1、NLRP3水平。同时将体外培养并转染的小胶质细胞BV-2分为control组、OGD组、agomir-NC组、miR-141组、miR-141+pcDNA3.1-NC组、miR-141+Keap1组;糖氧剥夺(OGD)法建立IR细胞模型。TargetScanHuman预测及双荧光素酶报告验证miR-141对Keap1的靶向调控关系;MTT法、AnnexinV-FITC/PI双染法测定BV-2细胞增殖、凋亡能力;再次应用ELISA法、qRT-PCR、Western blot检测白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、TNF-α、miR-141、Keap1、Nrf2、HO-1、NLRP3水平。结果过表达miR-141可促进IR大鼠神经功能恢复,减少脑梗死体积和细胞凋亡,降低IL-1β、IL-6、TNF-α、NLRP3水平,升高Nrf2、HO-1水平。BV-2细胞中miR-141能够负向调控Keap1表达,过表达miR-141抑制Keap1-Nrf2/HO-1信号通路,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,并下调IL-1β、IL-6、TNF-α、NLRP3的表达。结论miR-141能够靶向调控Keap1-Nrf2/HO-1信号通路,减轻IR的炎症反应,限制小胶质细胞激活,保护神经元。

基于QuEChERS前处理技术的水产品中喹诺酮类药物多残留ELISA检测方法的建立

建立了水产品中3种喹诺酮类（恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星）兽药多残留的新型Qu ECh ERS前处理技术结合酶联免疫快速检测的分析方法。基本流程为样品经90%乙腈（1%乙酸）均质提取离心后,上清液依次用C18净化、静置沉淀蛋白后用于测定,该前处理方法灵敏、快速、经济、实用性强。测试曲线线性范围为0.107~177.896ng/m L,检出限为0.0087μg/kg,IC50值为4.34ng/m L。样品批内和批间平均回收率分别为94.10%、93.70%,批内变异系数为4.09%~8.41%,批间变异系数2.78%~7.99%。检测结果与HPLC的相关系数R2=0.9897,表明酶联免疫检测方法及样品前处理方法适合喹诺酮类药物多残留检测。

高效液相色谱-串联质谱法测定动物肝脏中20种全氟烷基类化合物

建立了Qu ECh ERs-高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）同时测定动物肝脏中20种全氟烷基类化合物（Perfluorinated alkyl substances,PFAS）残留量的分析方法。样品用0.1%HCl-乙腈振荡提取,C18、N-丙基乙二胺（PSA）和石墨化碳黑（GCB）净化,在C18色谱柱,以5 mmol/L NH4Ac甲醇溶液和5 mmol/L NH4Ac溶液为流动相进行梯度洗脱。多反应监测（MRM）负离子模式,采用基质匹配同位素内标法和外标法结合进行定量分析。20种PFAS在0.1～10μg/L浓度范围内呈线性关系,相关系数不小于0.995;检出限为0.05～0.2μg/kg,定量限为0.4～0.5μg/kg。动物肝脏中20种PFAS的3个浓度水平（0.5,2和5μg/kg）加标的平均回收率为70.3%～108.1%,相对标准偏差（RSD）在2.1%～11.9%（n=6）之间。

在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱联用检测烟叶中的农药残留

采用改进Qu ECh ERS方法,以石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基键合硅烷/磁性四氧化三铁复合材料为吸附剂,对烟叶提取物进行净化,结合在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱联用仪,建立了烟叶中10种农药残留的检测方法。优化了影响实验结果的参数,最终凝胶渗透色谱在线收集时间选取为3.30~5.30 min、磁性吸附剂用量为80 mg、净化时间为1.0 min。目标物的检出限在0.940~100 ng/L之间,线性相关系数R2≥0.9989,日内和日间相对标准偏差分别小于15.1%和19.8%,实际样品的加标回收率为68.8%~132.2%。本方法成功应用于实际烟叶样品的检测,检测结果与现行标准方法相吻合。

QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定植物性食品中30种氨基甲酸酯类农药残留

基于欧洲标准化委员会标准方法（EN 15662）对食品基质的分类,选择6种代表性植物性食品作为基质,系统优化了Qu ECh ERS样品前处理方法;在此基础上,建立了30种氨基甲酸酯类农药的液相色谱-串联质谱分析方法。实验结果表明,除涕灭威砜的线性范围为2～100μg/kg,其他29种氨基甲酸酯类农药的线性范围均为1～100μg/kg;6种样品基质在3个添加水平（5、20、100μg/kg）下的回收率为56.13%～127.6%,相对标准偏差为0.47%～16%;以信噪比（S/N）≥10计,30种农药的定量限（LOQ）为0.041～1.9μg/kg。本文方法灵敏、有效,适用于植物性食品基质中30种氨基甲酸酯类农药残留的测定。

稀土积累对植物病原细菌生长的影响

本文研究了单一稀土氧化镧（Ｌａ２Ｏ３）在浓度为５０，１００，１５０，２００，２５０，３００，３５０，４００，５００，６００，７００ｐｐｍ时对植物病原细菌（Ｅｒｗｉｎｉａｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ，Ｅｃｈ，Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ，Ｘｏｏ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ，Ａｚ；Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ，Ｃ３）生长的影响。在平板培养基中，当稀土浓度大于１００ｐｐｍ时，Ｅｃｈ，Ｘｏｏ，Ａｚ三种细菌菌落出现时间均比对照延迟，Ｃ３在所有处理中不生长。稀土浓度越大，菌落出现时间越迟，在５０～３５０ｐｐｍ内，不同菌落出现时间延迟１２～４８小时。随着稀土浓度提高，生长量逐渐减少，至４００ｐｐｍ时，所有菌不生长。在液体培养基中，当稀土浓度小于２００ｐｐｍ，培养时间为２４小时时，可刺激Ｅｃｈ菌的生长。除此之外，不同稀土浓度不同培养时间下，稀土对植物病原细菌均有一定的抑制作用，抑制作用随稀土浓度提高而增加，至３５０ｐｐｍ时，几乎完全抑制病菌生长，其中对Ｃ３的抑制作用最明显。