Echinocandin B的分离纯化工艺研究

目的开发echinocandin B的分离纯化工艺。方法采用大孔吸附树脂吸附解吸-溶剂萃取-溶剂结晶的分离纯化方法。结果 HZ830树脂为最佳吸附剂,吸附流速选择为2BV/h,洗脱剂为85%乙醇,结晶溶剂为丙酮。在此实验条件下所得产品纯度≥95%,提取总收率大于60%。结论此方法简单,分离效果好,适于工业化生产。

基于脱酰基酶转化阿尼芬净前体echinocandin B条件的研究

脱酰基酶可以将echinocandin B(ECB)脱去酰基侧链得到ECB母核,用于化学合成抗真菌药阿尼芬净。本研究考察了以二甲基亚砜(DMSO)助溶剂的转化体系脱酰基酶对ECB转化的各因素,建立了转化工艺(磷酸缓冲浓度:0.02mol/L,pH7.0,KCl浓度:0.68mol/L,DMSO浓度:15%,ECB浓度:450mg/L,加酶量:10%,转化温度:40℃)。为了提高转化效率,探索了新的转化体系即以β-环糊精助溶剂的转化体系,其优势为:当ECB与β-环糊精的浓度比为1:6时,ECB可在体系中完全溶解,底物浓度可以达到2g/L。

新来源棘白霉素B脱酰基酶产生菌的筛选和转化条件优化

目的筛选放线菌来源的棘白霉素B脱酰基酶产生菌,并对其转化条件进行优化。方法根据菌株转化产物对白念珠菌的抑制活性进行初筛,再以HPLC、LC-MS检测确定目的菌株;对目的菌株转化棘白霉素B的培养基、转化温度和时间、缓冲液、甲醇含量等条件进行优化以提高转化率。结果筛选得到4株可产生脱酰基酶的阳性菌株,其中,N07W-.61为小单孢菌属菌株,其余3株为链霉菌属菌株;通过转化条件优化,菌株N07W-61对棘白霉素B的转化率从2.60%提高至61.24%。结论小单孢菌属菌株产生棘白霉素B脱酰基酶为首次报道;该属菌株N07W-61在优化转化条件下对棘白霉素B的转化率有了大幅提高。

棘白菌素B脱酰基酶工程菌的构建及酶学性质研究

棘白菌素B(ECB)脱酰基酶能选择性催化水解脱去ECB酰基侧链,得到ECB母核,可用于合成新型抗真菌药物阿尼芬净.从实验室保藏的犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)ZJB-0801基因组中克隆到ECB脱酰基酶基因,并将其构建入表达质粒pSET152,通过接合转移的方法将表达质粒导入到天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3中,构建可以高效表达ECB脱酰基酶的工程菌.对重组ECB脱酰基酶的酶学性质进行了考察,结果表明:重组酶的最适反应温度为45℃,最适pH为7.5.Zn^(2+),Mg^(2+),Mn^(2+),Fe^(2+)对重组酶有显著的激活作用,而Cu^(2+),Co^(2+)具有显著地抑制作用.动力学参数分析表明:该酶对底物ECB的K_m和V_(max)分别为0.356mmol/L和397μmol/(min·mg).

聚合物纳米微球分离纯化棘白霉素B母核方法研究

以聚合物纳米微球为层析介质,采用HPLC检测方法,开发高纯度棘白霉素B母核的分离纯化工艺,并对层析条件进行优化。结果表明,当选择Uni PS 30型聚合物纳米微球为层析介质、上样量为1.2g·(100g介质)-1、以体积分数为3%的乙醇进行洗脱、流速为12mL·min-1时,得到的棘白霉素B母核纯度大于98%。建立了高纯度棘白霉素B母核的分离纯化工艺,流程简单、可行,为该产品产业化开发提供了一定的理论基础。

棘白霉素B脱酰基酶产生菌N07W61的分类鉴定

菌株N07W61是由前期筛选获得的具有棘白霉素B脱酰基酶活性的菌株.通过形态特征、培养特征观察、生理生化特征、胞壁分析及16SrDNA基因序列同源性分析等多相分类研究对该菌株进行了鉴定,结果表明N07W61属于小单孢菌属(Micromonospora).

棘白菌素B提取液脱色工艺

研究碱性阴离子交换树脂WD-6对发酵棘白菌素B(ECB)提取液的脱色效果。通过对ECB提取液和ECB标准溶液的全波长扫描,确定ECB提取液中色素的最佳吸收波长为315nm;考察了树脂添加量、脱色温度、摇床转速和脱色时间对脱色率和ECB损失率的影响,获得最佳脱色工艺:树脂添加量4%(质量分数),脱色温度30℃,摇床转速150r/min,脱色时间100min。在此条件下,ECB提取液的脱色率可达88.3%,ECB损失率仅为4.8%。

阿尼芬净关键中间体棘白菌素B的加压毛细管电色谱分析

目的 建立抗真菌药物-阿尼芬净关键中间体棘白菌素B（Echinocandin B,ECB）加压毛细管电色谱分析（pCEC）方法.方法 采用流动相为乙腈-4.35mmol/L的磷酸盐缓冲盐（pH 5.5）（52∶48,V/V）,等度洗脱,流速为0.08mL/min,紫外检测波长212nm,分离电压-15kV.结果 各组分在0.015～3.84mg/mL范围内线性良好;检出限和定量限分别为15和30μg/mL;日间和日内精密度均小于5％;加样回收率均高于98％.结论 该方法简单方便,重现性好,准确可靠,回收率较高,为阿尼芬净中间体ECB的分析和质量控制提供了新的方法.

大孔吸附树脂分离纯化棘白霉素B母核的工艺研究

研究了大孔吸附树脂分离纯化棘白霉素B母核(ECBN)的工艺条件。以大孔吸附树脂D303为脱色树脂、HZ835为吸附树脂,将ECBN滤液pH值调至5.5进行吸附,吸附量为14 512μg·mL^(-1);再以5%乙醇水溶液为解吸剂解吸,解吸率为91.8%;最后经纳滤浓缩、脱炭、结晶、真空干燥等工艺得到ECBN粗粉,含量为65%左右,色谱纯度大于80%,提取总收率超过60%。该工艺简单易行、操作成本低、溶媒消耗少,适合工业化生产。

阿尼芬净合成前体棘白菌素B发酵条件优化

阿尼芬净为新一代棘白菌素类抗生素,其前体物质棘白菌素B(ECB)发酵单位的高低将直接影响阿尼芬净的市场前景.利用构巢曲霉发酵合成ECB,采用单因素实验考察不同参数对ECB产量的影响.结果显示:低温培养有利于ECB的合成,选择前3天37℃培养,后9天25℃培养,ECB产量可达1 237 mg/L,比25℃恒温培养提高了69.9%;最佳的初始pH为6.5;添加0.6g/L ZnCl2可使ECB产量达到1 100mg/L,比初始发酵培养基提高了69.2%;前体物质脯氨酸及鸟氨酸的添加可以显著提高ECB产量,在第6天添加2g/L脯氨酸或在第3天添加2g/L鸟氨酸可使ECB产量分别提高57.4%和55.2%.

棘白霉素B脱酰基酶高产菌株的选育及转化条件优化

目的为提高棘白霉素B脱酰基酶产生菌的转化率。方法采用常压室温等离子体诱变复合链霉素抗性筛选转化高产菌株;对新菌株转化棘白霉素B的底物溶剂、转化温度和转化时间等条件进行优化。结果获得稳定突变株ZH-6-78比出发菌的转化率提高了26.7%;优化后转化条件为:转化温度35℃,转化时间24h。结论高产菌种在优化的转化条件下,转化率达到90%,比出发菌原工艺提高了50.0%,为工业化生产奠定基础。

棘白霉素B母核在低级醇-丙酮体系中的纯化研究

棘白霉素B母核(ECBN)结晶纯化是提取步骤中最为重要的一个步骤,通过实验,摸索出了ECBN的最佳结晶条件,乙醇/丙酮为最优纯化体系,当混合液中乙醇含量为4%~5%,混合液用量为浓缩液的10~14倍体积时,棘白霉素B母核有很好的纯化效果和较高的收率。

氨基酸前体对棘白霉素B发酵合成的影响

以构巢曲霉(Aspergillus nidulans)发酵生产酯肽类化合物棘白霉素B,研究棘白霉素B己肽环结构的前体性氨基酸对产物的代谢影响,显示出脯氨酸、鸟氨酸、苏氨酸在发酵48 h补入,对发酵代谢有促进作用。利用响应面统计学方法进行前体及有机氮源配方优化,得出优化配方:脯氨酸4.55 mg/m L,鸟氨酸1.85 mg/m L,苏氨酸0.97 mg/m L,棉籽粉2.62%,摇瓶发酵水平达到3 270μg/m L,较原水平提高30.2%。新工艺在50 L罐上放大,发酵水平进一步提高至3 520μg/m L,显示出良好的工业应用前景。

5 L发酵罐中棘白菌素B发酵工艺参数优化

棘白菌素B(Echinocandin B,ECB)是抗真菌药物阿尼芬净的前体物质,主要通过微生物发酵合成。实验对构巢曲霉(Aspergillus nidulans ZJB09223)在5 L发酵罐中的培养条件进行了初步探索,考察了不同的搅拌桨类型、搅拌转速以及通气量等对棘白菌素B发酵过程的影响,为实现阿尼芬净的工业化大规模生产探明基本条件。结果表明,与双折叶式搅拌桨和框式搅拌桨相比,六直叶圆盘涡轮搅拌桨更适合ECB的发酵过程。在5 L机械搅拌式发酵罐中,最佳通气量为1. 7 VVM,在发酵前6 d,搅拌转速控制为600 r/min,后9 d搅拌转速控制为400 r/min,可以提高ECB的发酵产量。在该工艺条件下ECB发酵产量为608 mg/L,比优化前提高了193%。

棘白菌素B脱酰基酶的研究

棘白菌素B脱酰基酶是合成阿尼芬净重要中间产物棘白菌素B母核的关键酶。本文综述了近年来国内外学者对该酶的成熟机制、酶学性质、重组表达及生物催化应用等方面的相关研究进展。

棘白霉素B液体发酵培养的菌丝形态研究及发酵工艺优化

目的明确棘白霉素B的菌丝形态特点,建立新的棘白霉素B发酵工艺。方法以构巢曲霉(Aspergillus nidulans)NCPC1246为出发菌株,发酵产生新型芬净类抗真菌药物阿尼芬净(anidulafungin)先导性化合物棘白霉素B(echinocandin B,ECB)。通过激光诱变和显微镜检,对菌球直径、菌丝形态变化规律和ECB产量进行相关性分析。依据ECB菌丝形态特点,优化发酵工艺。结果通过激光诱变筛选得到突变株NCPC1246-36,其菌球直径约为1.0~1.2mm,具备球形紧实内核。依据菌丝形态特点,调整摇瓶通气量参数和培养周期,确定八层纱布、转速220r/min和周期为168~192h。在50L发酵罐上尝试新的通气量和周期工艺,放罐单位达到(3354±47)μg/mL,较原工艺水平提高37.6%±0.9%。结论棘白霉素B发酵中,遵循菌丝形态特点,调整通气条件和培养周期,可以获得高产量。

实体器官移植术后真菌感染的防治

经过近70年的发展,器官移植已经成为多种终末期疾病的有效治疗手段。但器官移植受者术后需服用免疫抑制剂,导致免疫功能低下,感染的发生率较高,包括病毒、细菌和真菌感染。其中真菌感染发病较隐蔽,早期诊断较困难,假丝酵母、曲霉、隐球菌、肺孢子菌感染是实体器官移植中比较常见的真菌感染。识别实体器官移植术后真菌感染的高危因素,提前预防,术后结合1,3-β-D葡聚糖试验(真菌G试验)、影像学检查和相关体液培养结果,做到早期诊断、早期治疗,对降低实体器官移植术后真菌感染的发生率及相关的病死率具有较大的临床意义。本文就器官移植术后常见的真菌感染进行综述,以期为器官移植术后真菌感染的防治提供参考。

酰基酶在棘白霉素类抗真菌药物生产中的应用（英文）

棘白霉素类化合物是最早发现的能抑制真菌细胞壁合成的天然产物,其中阿尼芬净和米卡芬净2种棘白霉素衍生物已经被广泛地应用于临床。它们的合成途径包括一个关键步骤,将天然产物棘白霉素B(ECB)和FR901379的6元环状多肽核上的长链脂肪酰侧链分别用非天然酰基侧链取代。阿库来菌素A酰基酶(AAC)和FR901379酰基酶能催化ECB和FR901379脂肪酰侧链的水解,生成的ECB和FR901379的环状多肽核可用于阿尼芬净和米卡芬净的生产。AAC和FR901379酰基酶对棘白霉素类化合物的酰基有很强的水解活性,而且这2个酶能在链霉菌中异源生产,因此它们成为棘白霉素类药物工业生产中广泛应用的绿色生物催化剂。本文介绍了ACC和FR901379酰基酶的酶学特性与应用。

EchinocandinB微生物转化工艺优化

犹他游动放线菌产生的酰基水解酶可以将echinocandin B(ECB)水解脱去酰基侧链得到ECB母核,用于化学合成抗真菌药阿尼芬净。本研究考察并优化了犹他游动放线菌产酶的发酵培养基组分和ECB转化反应体系的有机溶剂、底物浓度,建立了ECB的微生物转化工艺。结果表明,在含麦芽糖30 g/L和麦芽浸粉20 g/L的发酵培养基中,犹他游动放线菌发酵培养72 h后,加入终浓度为2.55 g/L的ECB和7.5%甲醇,转化18 h,ECB的转化率为97.8%。进一步在5 L发酵罐中进行发酵培养和微生物转化,结果表明该微生物转化工艺可用于制备ECB母核。

热带念珠菌耐药机制的研究进展

近年来侵袭性念珠菌感染中分离出的热带念珠菌比例呈逐渐增加趋势,热带念珠菌唑类耐药率也呈上升趋势,耐棘白菌素和两性霉素B热带念珠菌分离菌株的出现,增加了临床念珠菌感染的治疗难度。本文就热带念珠菌对唑类、棘白菌素和两性霉素B耐药机制进行综述。